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1、本科毕业论文（设计）论文（设计）题目：降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究学 院： 农 学 院 专 业： 农业资源与环境 班 级：09 农 资 学 号：0909010165 学生姓名： 指导教师： 2013年 5 月 28 日III 贵 贵州大学本科毕业论文（设计） 目 录摘 要IIAbstractIII1前言11.1研究意义及目的11.2纤维素分解细菌的简介11.3国内外研究概况22材料与方法32.1供试样地区域概况32.2样品基本理化性质32.3研究内容和技术路线42.3.1主要研究内容42.3.2技术路线图42.4培养基52.5主要试剂和仪器52.5.1试剂52.5.2主要仪器
2、62.6方法72.6.1分离、纯化72.6.2细菌初筛72.6.3细菌生长曲线的测定72.6.4纤维素分解细菌的复筛83结果与分析103.1分离、纯化结果103.2菌株初筛结果103.2.1初筛情况统计103.2.2初筛的保存123.3细菌生长曲线测定结果123.4纤维素分解细菌的复筛结果133.5滤纸条崩解实验154结果与讨论17参考文献19致 谢20降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究摘 要本试验从茅台酒厂提供的样品中分别从30和50下分离出能分解利用羧甲基纤维素（CMC-Na）的细菌共244株。经革兰氏碘液染色，在CMC-Na培养基上生成透明圈与菌落半径的比值大于5.0的有10
3、3株，大于10.0的有12株，其中，菌株BL5-95的透明圈与菌落半径比值最大，达到15.0。在这103株菌中，产透明圈半径大于1.5 cm（30）和2.0 cm（50）的菌株有20株。本试验分别从50C和30培养筛选条件下选取7株和6株，对这些菌株进行纤维素酶活及其他各项指标的测定。菌株的生长曲线试验分别在30（中温）条件下静置培养和50（高温）条件下振荡进行培养。通过不同温度分离筛选条件下得到的菌株分别在其对应温度下的生长曲线可以看出，高温振荡培养的菌株会在试管表面长出菌苔，菌液澄清，试管底部有沉淀；中温静置培养条件下的菌株菌液整体浑浊，分布均匀。高温振荡培养的菌株在培养前期（12 h）生
4、长快于低温静置培养的菌株，但培养3 d后，二者生长趋势趋向一致，但中温条件下筛选的部分菌株（BL5-106）性能优于高温条件下筛选得到的菌株。通过纤维素酶活力鉴定，菌株BL5-106的酶活力最高，达到93.87 U/mL，表明该菌株最具研究价值，该探究也为下一阶段的堆肥试验提供了前期准备及研究用菌。关键词：纤维素分解细菌，酶活性，纤维素酶，筛选Screening of Vinasse Cellulose Decomposing Bacteria and Research on Enzyme ProductionAbstract244 bacteria strains which could f
5、orm a sharp and distinct zone around the cellulase-producing microbial colonies on carboxymethylcellulose (CMC) plates with Grams iodine had been isolated. There were 103 strains which the radius ratio of distinct zone and colony was more than 5.0, and among which, the radius ratio was more than 10.
6、0 were 12 strains. Especially, the radius ratio of strain BL5-95 was the highest (15.0). The strain number which the radius of distinct zone was more than 1.5 cm under 30 and more than 2.0 cm under 50 conditions was 20. In this study, 7 strains from 50 conditions and 6 strains from 30 conditions had
7、 been chosen to assay the active of cellulases and other index.The growth curve of strains test were cultured under 30 static culture and 50 oscillation conditions, respectively. There were lawns appearing on the culture medium surface, and the liquid were clarification under oscillation conditions.
8、 However, there was precipitation in the bottom of the test tube. In contrast, the liquid were overall turbidity under static conditions. Strains cultured under 50 oscillation conditions grew faster than the strains from 30 conditions during the earlier incubation stage, however, the growth from dif
9、ferent conditions were consistency after incubation 3 d. The performance of strain BL5-1-6 from 30 conditions was better than the strains from 50 conditions.The cellulose active of BL5-106 was the highest, which was 93.87 U/mL. This study provides preparation and microbes for the composting experime
10、nt.Keywords: cellulose decomposing bacteria, enzymatic activity, cellulase activity, screening第 0 页 贵 贵州大学本科毕业论文（设计） 1前言1.1研究意义及目的酒糟是酿酒业最主要的副产物，在我国，每年白酒酒糟产量都在2500万t以上1。由于酒糟酸度偏大，可生化性较较强，极易腐烂，不便存储，若不及时处理，易对环境造成极大的污染2。酒糟生物质主要由纤维素和木质素构成，同时含有一定的残余糖分、淀粉、粗脂肪和蛋白质3，因此，可利用具有降解纤维素的菌种对其进行分解，把其中部分纤维素转化为有机质等，从而提高
11、酒糟的综合利用效率4。对纤维素酶产生菌的研究过去多集中于真菌的研究和应用，鉴于细菌繁殖和产酶速度快、发酵周期短，有利于工业生产，故近年来对细菌产纤维素酶日益引起重视。纤维素酶的比活力一般都很低，因而产酶成本高。据估计，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的酶蛋白多100倍，这是影响纤维素酶实际应用的重要原因之一5。因而，筛选纤维素酶比活力高的菌株无疑具有重要的意义。本试验针对酒糟生物质降解慢的难题，拟从茅台酒厂提供的样品中分离细菌，筛选出酶活性较高的纤维素细菌菌株，对筛选的菌株进行产酶特性初步研究，以此为依据优化产酶条件，以期为酒糟综合利用研究提供科学依据。1.2纤维素分解细菌的
12、简介能产纤维素酶的细菌种类虽不如真菌，生孢食纤维菌属( Sporocytophaga ) 、有报道的食纤维菌( Cytophaga) 、多囊纤维菌属( Polyangiumcellulosum) 等属细菌均有较强分解纤维素的能力6 。酶活较强的菌种有纤维杆菌属(Culmolnoas)、生孢纤维菌属(sporocytophaga)7和梭菌属(cellulomonas)。研究最多的是纤维单胞菌（Cellulomonas）8-9和热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。根据细菌的生理学特性，一般将纤维素降解细菌分类为：厌氧型、好氧型和好氧滑动菌。好氧细菌以可溶性胞外酶的形式分泌
13、出3种纤维素酶对纤维素进行水解， 如纤维杆菌属(Culmolnoas)的纤维单胞菌。第 20 页 贵 贵州大学本科毕业论文（设计） 厌氧细菌将3 种纤维素酶以特定方式联合组装成一个大复合体 纤维小体(cenulosome)10，具有多种功能的超分子结构。纤维小体附着在细菌细胞表面，所以细菌需要粘附在纤维上，使纤维小体在纤维的接触点处对纤维素进行水解，如热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。研究表明，细菌在降解纤维素过程中产生纤维素酶的量较少，且大多不能分泌到细菌细胞外，其大多数对结晶纤维素没有活性，在降解纤维素能力方面，细菌明显低于真菌，因此，很少将细菌投入到工业生产中
14、11。1.3国内外研究概况在关于纤维素酶活性及发酵时间、温度对产酶的影响研究方面，江龙法等12从白酒糟采集的样品中初筛得到产纤维素酶酶活较高的5株菌。纤维素酶和滤纸酶活研究结果表明，这5 株菌在分泌纤维素酶活力及降解滤纸能力方面均较强，其分解纤维素的酶活最高达到11.9 U/ mL，而分解滤纸的酶活力则最高达到64 U/ mL。最适产酶条件为：发酵时间72 96 h，发酵温度25 30C。对酒糟发酵减重最高达18%。李日强等12通过对发酵处理后的玉米秸秆和白酒糟的分析，玉米秸秆经发酵处理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸总量分别比发酵处理前高了576.4 %，31.2 %和501.9 %；白酒糟经发
15、酵处理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸总量分别比发酵处理前高了65.3 %，64.0 %和50.9 %，而且都具有较高的半纤维素酶和纤维素酶活性，可对秸秆和白酒糟进行持续降解，进一步提高了消化率。秦广利等13在酒糟中提取酒的研究也有了新发现，结果表明，在残糟中添加纤维素酶10 U/g，于58C的水浴锅中保持5 h，可以提高还原糖的含量，残糟发酵酒精度达到4.67 %vol，出酒率达到31.39 %，出酒率比原糟提高了2.61 %，蒸馏出的产品达到蒸馏白酒各项卫生指标，达到优质酱香白酒的要求，提高了酱香型白酒酒糟的利用价值。在纤维素利用的研究中，研究的对象多偏重于厌氧高温纤维素分解菌，好氧高温纤维素分解菌涉及较少；研究内容多偏重于分类学方面以及菌株在厌氧发酵纤维素类物质方面的应用。酒糟的利
