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1、南京晓庄学院2012届本科毕业论文 分 类 号： 学校代码： 11460 学 号： 08411428南京晓庄学院本科生毕业论文根癌农杆菌介导转化AtNHX1基因甘蓝型油菜的研究Research of AtNHX1 Gene transformation in Brassica napus by Agrobacterium tumefaciens 所在系（院）：生物化工与环境工程学院学 生 姓 名： 指 导 教 师： 研究起止日期：二一一年三月至二一二年五月二一二年五月根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化甘蓝型油菜的研究学 生： 指导老师：摘要：以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体，通过根癌农杆菌介导法
2、，将Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1基因转入甘蓝型油菜中。结果表明，外植体经浓度OD600为0.4的菌液中侵染8-10min，卡那抗性绿苗率达3.75，经过对抗性植株的PCR检测证明外源基因已经整合到油菜基因组中，为提高甘蓝型油菜的耐盐能力提供了新的途径。关键词：根癌农杆菌；带柄子叶；卡那霉素；转基因甘蓝型油菜；Research of AtNHX1 Gene transformation in Brassica napus by Agrobacterium tumefaciensStudent: LiangYi Tutor: Cai Xiao-ningAbstract： Chosen co
3、tyledon petiole as the recipient for transformation. AtNHX1 gene was transferred into Brassica napus by Agrobacterium tumefaciens transferring system. The results showed that the best physiological and transforming condition was in OD600 0.4 liquid bacterium for 8-10 min, 3.75 kan-resistant green se
4、edings were obtained. It was proved that NHX gene was inserted into the genome of oilseed by the methods of PCR.It could provide a new way to improve the salt tolerance about Brassica napus. Keywords：Agrobacterium tumefaciens;Cotyledons with petiole; Kanamycn；Transgenic Brassica napus; 目录引 言41 实验材料5
5、1.1 植物材料51.2 菌种及质粒51.3 抗生素51.4 培养基的种类51.4.1植物培养基51.4.2细菌培养基51.5 农杆菌菌液的制备62 实验方法62.1 无菌苗的培养62.2 油菜基因型的筛选62.1.2预培养62.1.3分化培养62.1.4继代培养62.1.5生根培养62.1.6再生苗的移出62.3 植物表达载体PX6- AtNHX1转化甘蓝型油菜62.3.1预培养62.3.2外植体的侵染72.3.3共培养72.3.4筛选培养72.3.5继代培养72.3.6抗性苗的获得72.3.7生根培养72.4 转基因植株的检测72.4.1甘蓝型油菜DNA的提取72.4.2PCR基因扩增82
6、.4.3基因条带的检测93 实验结果93.1 不同基因型对甘蓝型油菜外植体分化率的影响93.2 芽苗的生根培养103.3 再生苗的移出113.4 植物表达载体PX6- AtNHX1转化得到的油菜123.5 芽增殖的培养143.6 转基因甘蓝型油菜的检测结果144 讨论15参考文献：17致 谢18引 言 土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性问题，土壤盐渍化严重影响着农业的产量，尤其是使灌溉农业作物减产。同时盐分过高还可使土壤盐渍化，限制土壤的利用。目前，世界上大约20%的耕种土地和接近一半的灌溉土地都遭到了盐胁迫的危害1。高盐环境是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。分子生物学的发展，使人们能够
7、在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对盐逆境胁迫的耐(抗) 性机理，从而通过基因工程手段改良植物耐(抗) 盐性。随着分子遗传学和植物转基因技术的快速发展，采用生物技术提高作物的耐盐性，使作物在盐胁迫环境中能够正常生长并提高产量，正受到越来越多的关注，并取得了一定的成果。提高作物耐盐性的方法有很多，如改造生物合成途径，在作物体内表达耐盐相关基因或改变基因对胁迫的反应特性等2-3。NHX（Na+/H+ antiporter）为液泡膜中的一种Na+/H+反向运输体4，可促进离子在液泡中的分室效应，同时还可减少细胞毒性。在转基因拟南芥和转基因西红柿中过量表达AtNHX1，可在液泡膜中积累
8、大量的运输体，并且极大地提高了它们的耐盐性5,6。这些结果显示出AtNHX 家族在钠离子的液泡分室效应中起着关键的作用。油菜是我国主要的油料作物之一，随着农业生物技术的发展，人们越来越重视基因工程技术改良油菜品种，成功的基因转化主要依赖于良好的植物受体系统的建立。从整体上看，油菜遗传转化的效率均不是太高，这主要与油菜低频率的再生有关。因此，建立高效的再生体系是油菜遗传转化研究的焦点之一。近几年的研究表明，油菜再生频率与外植体类型、基因型、生长调节剂、外植体生理状态以及AgN03有关7-9，通常的激素组合为生长素类与6-BA组合，未见使用苯基脲类细胞分裂素噻苯隆(TDZ)的研究报道。自1974年
9、KarthaL首次从甘蓝型油菜的茎切片诱导出小植株以来，国内外对甘蓝型油菜的体细胞和组织培养技术相继进行了研究。在再生体系的建立中，已从甘蓝型油菜的不同外植体如幼茎、花茎等诱导产生了植株10-11，但这些外植体的再生途径多具有周期长、再生率低，而且种质易产生变异的特点。在油菜的离体培养试验中发现，子叶柄、下胚轴就具备再生周期短、再生率高、培养程序简单等特点，此外，油菜子叶、下胚轴易被农杆菌感染和转化，因此一般作为再生和转化体系的首选外植体。pX6-GFP是Zuo等对Cre/lox系统进行改进选择标记载体，并应用于模式植物拟南芥，成功地获得了去除卡那霉素抗性标志，只表达目的基因GFP的拟南芥转基
10、因植株10。PX6-GFP载体与其他载体有所不同：此载体在转化过程中以雌二醇诱导，可以剔除插入的选择标记基因12。目前，几乎所有的植物遗传转化都要通过使用选择标记基因，如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子。 虽然没有研究结果表明选择标记基因影响人类健康或环境安全，但近年来也引发了人们对转基因产品安全性的担心。为了消除人们对转基因食品的安全性顾虑，无选择标记的转基因植物是一种比较好的选择。本试验，采用根癌农杆菌介导法，应用cre/lox植物表达载体，研究了Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1基因对甘蓝型油菜进行转化。1 实验材料1.1 植物材料油菜种子（N336,N370,N206,N115）
11、，在冰箱-20中保存。1.2 菌种及质粒农杆菌菌株为PBI 121，质粒为PX6- AtNHX1 。1.3 抗生素卡那霉素（Kana），氨苄青霉素（Ap），利福平（Rif）、壮观霉素（Spel）。1.4 培养基的种类1.4.1植物培养基预培养基：MS+1.0 mg/l 2,4-D共培养基：MS+2mg/l 6-BA+0.2 mg/l NAA 分化培养基：MS+3mg/l 6-BA+0.05mg/l NAA+1.0mg/l TDZ 筛选培养基：MS+3mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+10mg/l KANA+500mg/l AmP增殖培养基：MS+1.0 mg/l BA+0.1mg/l
12、 NAA继代培养基：MS+0.02mg/lNAA+5mg/L6-BA生根培养基：MS+0.05mg/lNAA注： 以上培养基均附含30g/L蔗糖,4.5g/L琼脂,pH 5.8,若培养基中需加抗生素的，要在培养基冷却到60后再加入。且各培养基中所用的Ap,kana等均采用过滤灭菌,其它则在121下进行高温高压灭菌。1.4.2细菌培养基 根癌农杆菌培养基为LB 液体培养基(10 g/L 胰化蛋白胨, 5 g/L 酵母提取物,10 g/L 氯化钠, PH 7.0)，在121下进行高温高压灭菌。1.5 农杆菌菌液的制备从划线培养平板中挑取单菌落，制成可转化的菌液，吸取100ul菌液于50ml LB中
13、，28，150rpm 震荡培养2天（即菌种的活化）。活化之后，从活化的菌液中吸取100ul菌液于另一瓶LB中，28，180rpm震荡培养6h至OD600值到0.30.4（细菌进入对数生长期），待用。为防止有杂菌产生，以上LB培养基中均要加入抗生素50mg/l Rif 和50mg/l Spe。在超净工作台上进行，待灭菌过的LB培养基低于60，用已灭菌过的枪头将抗生素加入到培养基中。2 实验方法2.1 无菌苗的培养1.将超净工作台的紫外灯打开，紫外杀菌20min。2.种子的灭菌：选取籽粒饱满、大小均一的油菜种子, 用75%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞处理5-8min，无菌水反复冲洗8-10
14、遍。3.将已灭菌的种子，播种于MS 培养基上，置25、16h 光照/8h 黑暗的光照周期下培养一个星期左右,得到无菌苗。2.2 油菜基因型的筛选2.1.2预培养取无菌苗放于无菌纸上，取其带柄子叶和下胚轴，以每瓶8-10的数目分别将带柄子叶和下胚轴接入到预培养基中，培养2天。2.1.3分化培养将培养了两天的外植体转入到分化培养基中培养。2.1.4继代培养待分化培养基中的外植体有再生芽长出，将再生芽转到继代培养基中进行培养（图1）。2.1.5生根培养待再生芽长有7-10cm时，转到生根培养基中，直至有根长出（图2和图3）。2.1.6再生苗的移出将长出根的再生苗移到花盆中长成大的植株（图4）。2.3
15、 植物表达载体PX6- AtNHX1转化甘蓝型油菜2.3.1预培养取一周龄的无菌苗，切取其带柄子叶接种于含1.0mg/L 2,4-D 的MS0 预培养基中, 预培养3d。叶柄切口朝下，外植体切口处刚刚开始膨大时即可用于侵染。2.3.2外植体的侵染将预培养的带柄子叶浸入到装有OD600=0.4左右的锥形瓶中摇晃8-10min，取出放入垫有数层无菌滤纸的培养皿中，以吸去子叶表面多余的菌液并在超净工作台上充分吹干。在预培养基上也垫上一层滤纸，将侵染好的叶片放回预培养基上进行共培养10。2.3.3共培养 将经过预培养之后的外植体接入到共培养基中，以第一片叶片上肉眼看出菌体时所需时间（d或h）作为最佳共培养时间。2.3.4筛选培养 将共培养后的外植体转移到附加卡那霉素10mg/L，氨苄青霉素500mg/L的培养基上筛选培养，(251)，16h光周期，大约4-5周后分化出芽，培养过程中注意观察生长状况。2.3.5继代培养选择有绿芽等
