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1、 第13章生物合成核酸类药物 核酸类物质药物一般可分为两大类 一类具天然结构的核酸类物质 另一类是自然结构碱基 核苷 核苷酸的结构类似物或聚合物 前者是生物体合成原料或蛋白质 脂肪 糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶 这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡 加速受损组织的修复 促使缺氧组织恢复正常生理机能 临床上已广泛使用于放射病 血小板减少症 白细胞减少症 急慢性肝炎 心血管疾病 肌肉萎缩等病症的治疗 包括肌苷 辅酶A GTP CTP UTP ATP 腺苷 辅酶I 辅酶 等 多数是生物体自身能够合成的物质 具有一定临床功能 毒副作用小 基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取 后一类药物
2、是治疗病毒感染性疾病 肿瘤的重要手段 也是产生干扰素 免疫抑制的临床药物 正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷 叠氮胸苷 阿糖腺苷等 核酸类物质生产方法有化学合成法 酶解法和发酵法三种 化学合成法生产 工艺比较复杂 设备条件要求较高 酶解法受到酶源及原材料的局限 发酵法以糖质原料生产核苷酸类物质 符合食用习惯 生产成本低 效益高 特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用 使发酵法生产成本大大降低 优势更为明显 主要核酸类发酵产物及其应用 13 1肌苷的发酵法生产 1 概述肌苷是近年来生产发展较快的一种生化药品 对不同类型的心脏病及肝脏病都有较好疗效 并具有无毒 无副作用的特点
3、另外 它还是唯一能代替人体内辅酶A功能的药物 肌苷经磷酸酯化后生成5 肌苷酸 用作鲜味剂的前体物质 主要生产国是日本 试验室产量已达80g L以上 我国实验室产量30g L左右 生产水平在20g L左右 肌苷化学名是次黄嘌呤核苷 是次黄嘌呤和核糖的缩合物 其磷酸酯为肌苷酸 在次黄嘌呤核苷中 核糖连在N 9位置上 以糖苷键的形式连接在以呋喃形式存在的核糖第一位碳原子上 分子式为C10H12N4O5 相对分子质量为268 23 肌苷为白色结晶或呈无水粉末状 无嗅 味微苦 熔点约为218 易溶于水 pH近中性 在饱和水溶液中约含肌苷15g L 在稀盐酸或氢氧化钠溶液中易溶 在氯仿 乙醇中不溶 肌苷的
4、结构式 2 生产菌种主要为细菌 如枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌 产氨短杆菌 谷氨酸棒杆菌 谷氨酸小球菌 节杆菌 铜绿色假单胞菌 大肠杆菌等 此外 一些酵母和霉菌也可产生肌苷 3 培养基斜面培养基 葡萄糖1 0 牛肉膏1 4 蛋白胨1 0 酵母膏1 0 氯化钠0 5 pH7 0 7 2 种子培养基 葡萄糖1 0 酵母膏1 5 蛋白胨1 0 玉米浆0 5 氯化钠0 5 pH7 0 7 2 发酵培养基 葡萄糖12 酵母粉1 4 硫酸铵1 3 玉米浆0 5 尿素0 2 氯化钾0 6 磷酸氢二钠0 5 硫酸镁0 22 碳酸钙2 0 pH7 0 7 2 灭菌条件 斜面培养基0 1MPa 20min 种子培养
5、基及发酵培养基0 08MPa 15min 4 生产工艺 5 发酵控制 碳源大多使用葡萄糖 在发酵生产中也可利用淀粉水解液 常用氮源有氯化铵 硫酸铵或尿素等 因肌苷的合氮量很高 20 9 所以须供应足够的氮源 工业发酵常用氨水来调节pH 这样既可以供氮源 又可调节发酵液的pH 磷酸盐对肌苷生成有很大影响 采用短小芽孢杆菌的腺嘌呤缺陷型发酵时 可溶性磷酸盐如磷酸钾显著抑制肌苷累积 不溶性磷酸盐如磷酸钙可促进肌苷的生成 采用产氨短杆菌变异株时 肌苷发酵不需要维持低水平无机磷 即使添加2 磷酸盐 也能累积大量肌苷 肌苷生产菌株一般为腺嘌呤缺陷型菌株 培养基中须加入适量腺嘌呤 如酵母膏等 由于腺嘌呤是肌
6、苷酸的前体 而腺苷酸又是控制IMP生物合成的主要因子 所以加入腺嘌呤的多少 不仅影响菌体的生长 更影响肌苷积累 腺嘌呤对肌苷积累最适浓度比菌体生长所需要的最适浓度小一些 称为亚适量 氨基酸促进肌苷积累 节约腺嘌呤用量 其中组氨酸是必需的 异亮氨酸 亮氨酸 蛋氨酸 甘氨酸 苏氨酸 苯丙氨酸及赖氨酸等8种氨基酸也有促进作用 除组氨酸外的其他8种氨基酸可以用高浓度的苯丙氨酸一种来代替 氨基酸可通过促进菌体生长使肌苷产量增加 发酵条件 如pH值 温度 通气搅拌等都是影响肌苷积累的重要因素 肌苷积累的最适pH值为6 0 6 2 最适温度对枯草杆菌为30 对短小芽孢杆菌为32 供氧不足可使肌苷生成受到显著
7、的抑制 而积累一些副产物 通气搅拌可减少CO2对肌苷发酵的抑制作用 6 肌苷的生理作用和药用价值 肌苷可直接透过细胞膜 进入人体细胞内 使处于低能缺氧状态下的细胞恢复正常水平 继续进行新陈代谢 并能活化丙酮酸氧化酶类 参与人体细胞蛋白质的合成 具有激活细胞 刺激代谢等作用 当细胞内ATP含量显著或持续下降时 细胞功能低下 此时细胞进入低能状态 ATP的加入可以解除这种低能状态 但ATP不能透过细胞膜 而肌苷对细胞有高度的渗透性 因此 肌苷是唯一代替人体增加ATP的药物 肌苷进入细胞后生成丙酮酸 丙酮酸可转化为辅酶A和乳酸 肌苷主要应用于心脏疾病 肝脏病 白细胞减少症 放射性照射病 贫血病 血吸
8、虫病 视网膜炎 神经萎缩 毛地黄中毒等症 肌苷可制成肌苷二醛 异丙肌 对精巢上皮瘤 麦粒细胞癌以及某些病毒性疾患都可以起缓解或抵抗作用 还可制造干扰素的诱导剂 此外 肌苷磷酸化后生成肌苷酸 是制造强力味精的前体物质 13 2肌苷酸的生产 肌苷酸由核糖 磷酸和次黄嘌呤组成 其中磷酸结合在核酸的第5位羟基上 肌苷酸的结构式 肌苷酸为白色结晶粉末状或颗粒状 味鲜 无臭 易溶于水 在乙醇或其他有机溶剂中溶解度极小 核苷和碱基容易透过细胞膜而核苷酸却难以透过 因此由微生物直接发酵法生产肌苷酸比较困难 可解除微生物自身反馈调节 改变细胞膜通透性 在发酵液中积累肌苷酸 发酵法得到的是肌苷酸钠盐 1 生产菌种
9、 有短小芽孢杆菌 产氨短杆菌 枯草芽孢杆菌 谷氨酸棒杆菌 某些链霉菌等 肌苷酸产生菌在Mn2 限量 20 g L以下 的条件下 菌体会产生膨胀异常形态 积累肌苷酸 因此认为细胞膜对肌苷酸存在透过性障碍 Mn2 使细胞通透性降低 2 肌苷酸生物合成途径 最初起作用的酶是PRPP氨基转移酶 该酶受AMP ATP及GMP的反馈抑制 被腺嘌呤阻遏 还有腺苷酸琥珀脱氢酶 SAMP脱氢酶 和GMP还原酶 诱变处理可获得SAMP脱氢酶缺失的腺嘌呤缺陷型突变株和缺失XMP氨化酶的鸟嘌呤缺陷型菌株更多地积累肌苷酸 肌苷酸合成途径 3 肌苷酸的生产工艺 肌苷酸的生产方法 1 将生物细胞内的呈味核苷酸用化学方法抽提
10、和精制 2 从微生物 例如酵母 细胞提取核酸后 再通过有关酶系进行核酸降解 3 用发酵法或合成工艺制得肌苷酸的前体物质 再经微生物转化而成 4 选育肌苷酸高产变异菌株 直接发酵生产 一般采用方法 2 和方法 4 生产肌酸 国外采用枯草芽孢杆菌 产氨短杆菌的营养缺陷型 抗代谢类似物 Mn2 不敏感抗生物素菌株 以糖类等为基质的发酵法得到稳步发展 效益显著 工艺路线如下 试管斜面培养 摇瓶种子培养 二级种子罐培养 三级种子罐培养 发酵 板框压滤 脱色 活性炭吸附 浓缩结晶 精制 4 肌苷酸的用途 肌苷酸可参与机体能量代谢以及蛋白质合成 活化丙酮酸氧化酶 能使细胞在缺氧状态下继续进行代谢 肌苷酸的主
11、要医用价值为白细胞或血小扳减少症 各种急慢性肝炎 肺原性心脏病 中心性视网膜炎 视神经萎缩症 放射线照射病 毛地黄中毒症以及血吸虫病等的治疗 肌苷酸更主要用途是作为助鲜剂 制成强力味精 第二代味精 和复合调味料 第三代味精 肌苷酸单独存在时 鲜味并不显著 但与谷氨酸钠 味精 并存时 该混合物鲜味随肌苷酸含量的增加而增强 此外肌苷酸可提高酱油品质 13 3鸟苷酸的生产 鸟苷酸由鸟嘌呤 核糖和磷酸三部分组成 磷酸结合在核糖的5 位羟基上 又名5 单磷酸鸟苷 分子式为C10H12N5O6P 鸟苷酸的结构式 鸟苷酸为白色晶体或粉末 溶于冷水中 能完全溶于碱溶液中 在冷的酸性溶液中缓慢分解 生产中多以钠
12、盐形式出现 鸟苷酸在菌体内的浓度超过一定限度 就会引起反馈调节 抑制鸟苷酸合成 尤其是使PRPP转酰胺酶 IMP脱氢酶及GMP合成酶等受到抑制 而且微生物中还普遍存在催化由GMP向乌鸟苷 鸟嘌呤降解的酶系 因此必须利用相关营养缺陷型进行发酵生产 鸟苷溶解度很低 发酵中容易析出结晶 减弱了反馈调节的效果 有可能积累鸟苷 GMP生产方法除RNA分解外 还有 1 生物和化学合成并用 利用微生物发酵法生产AICAR S 然后AICAR S 经过有机化学合成的方法制成GMP 2 利用细菌发酵生产鸟苷 然后以酶法或化学合成法将鸟苷进行磷酸化 得到GMP 3 双菌混合发酵 利用XMP或黄苷生产菌与能将XMP或黄苷转化为GMP的菌株混合培养法 4 利用直接发酵法生产GMP 目前 国内外多采用酵母提取核酸后进行酶解生产鸟苷酸 5 鸟苷酸有助鲜作用 与适量谷氨酸钠按不同比例混合时 其鲜昧更优于5 肌苷酸 在特鲜酱油方面也重要应用 在医疗方面 其钠盐用于治疗白细胞减少 血小板下降及肝炎等
