酶法合成研究进展.pdf

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1、 内酰胺抗生素的酶法合成研究进展内酰胺抗生素的酶法合成研究进展 内酰胺抗生素经过多年的发展 己成为抗生素中的最主要类型之一 由 于具有良好的抗菌效力 较低的毒副作用 在临床上广泛应用 其发展非常迅速 现全世界耗用量已过万吨 预计今后还会增长 其中 青霉素和头孢菌素为最重 要的两大类 内酰胺抗生素 酶法合成技术始于 20 世纪 60 年代末 70 年代初 经过 30 多年的发展 现在酶缩合反应技术 产品分离以及固定化酶技术等方面 取得很大的发展 配套技术日益完善 具备了大规模工业化生产的条件 全球著名的 内酰胺抗生素生产厂家如荷兰 DSM 公司已有酶法合成的商 品头孢氨苄 阿莫西林等产品面世 由

2、于酶法应用于 内酰胺抗生素合成 不 仅可减少反应步骤 而且还可减少废弃物的产生 有利于保护环境 降低生产成 本 产品质量优异 所含杂质极少 因此 21 世纪 内酰胺抗生素的酶法合成 将是发展的必然趋势 我国酶法合成研究起步并不晚 但至今仍未形成大规模工业化生产 与国外 先进厂家差距较大 随着我国经济快速发展 人们对自身居住环境的要求 政府 对环保的重视 政府和越来越多的企业加大 绿色化学制药 的研究开发 特别 是加快工业化生产的推进进程 现将近年来 内酰胺抗生素合成研究 产品的 分离纯化 酶反应器研究进行概述 1 现状现状 青霉素中如氨苄西林 阿莫西林等 头孢菌素中如头孢氨苄 头孢羟氨苄 头孢

3、克洛 头孢丙烯 头孢唑林等 这些产品有化学半合成法 简称化学法 和 酶半合成法 简称酶法 化学法是将母核与侧链以化学法缩合 现在世界上绝 大多数生产这些产品的企业使用的是化学法 常用的方法有酰氯法 混合酸酐法 Vilsmeier 法及活性醋法 酶法则是将母核与侧链通过酶催化缩合 化学法需要 较多的有机化学原料 如溶剂二氯甲烷 吡啶 二甲苯胺 反应条件苛刻 如 需无水条件 反应温度低 有的需低至零下 90 反应步骤多 产生大量的三 废需处理 这些产品酶法合成技术自 1969 年开始报道 但由于当时酶的性能较差 分 离纯化技术也一直未能很好的解决 因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生 产阶段 近

4、年来 随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展 酶法制备 内酰胺抗生素的技术也不断得到提高 2 酶催化合成研究进展酶催化合成研究进展 2 1 酶催化酰胺化缩合反应 酶法制备 内酰胺抗生素酰胺化缩合反应的研究涉及的品种有氨苄西林 阿莫西林 头孢氨苄 头孢拉定 头孢羟氨苄 头孢唑林 头孢丙烯 头孢克洛 等 酶催化缩合反应类型一般有两类 一类为热力学控制的酶催化缩合反应 另 一类为动力学控制的酶催化缩合反应 1 热力学控制的酶催化缩合反应 其特点是不必活化酰基配体 废物产生少 Schroen 等研究了不同 pH 溶 剂浓度和温度条件下 热力学控制的头孢氨苄酶法合成 pH 5 8 酶的稳定性 较好 p

5、H 4 酶的活性大大减弱 在水中直接合成 只有很少量的头孢氨苄生成 加入与水互溶的有机溶剂 甲醇和三甲醇二甲醚 有一定好的效果 头孢氨苄平 衡浓度增加 2 3 倍 最大为 0 25mmo1 L 36 三甲醇二甲醚 30 3d 研 究了不同侧链对产品平衡浓度影响 侧链有苯乙酸 溴苯乙酸 L 马来酸 D 马来酸 对羟基马来酸 吲哚乙酸 研究发现 当侧链为苯乙酸 产品平衡浓 度最大 2 8mmol L 当侧链带有 羟基苯乙酸 即马来酸 产品平衡浓度小 最小 0 6mmol L 结果表明 侧链结构对产品平衡浓度影响很大 酶可以是 游离酶 也可以是固定化酶 来源 E coli 虽然 热力学控制的头孢氨苄

6、酶法生 产头孢氨苄 由于产品平衡浓度低 应用价值不大 但提示对某些 内酰胺抗 生素 由于侧链结构特性 热力学控制的酶催化缩合有可能实施 Diender 等报道了热力学控制阿莫西林酶法合成 在水溶液中 加入青霉素 G 酰化酶 来源 E coli 同时加入有机溶剂 提高阿莫西林合成平衡常数和合成 缩合收率 Ulijn 等报道 以青霉素酰化酶 粗酶 游离态 为催化剂 通过沉淀产品 制备酸性和两性离子 内酰胺抗生素的研究 将苯乙酸和氨水溶液 底物 6 APA 悬浮物 直接加入到反应器中 加入酶催化剂 一边反应一边将产品沉淀 这 种热力学控制酶催化反应对青霉素 G 可行 但对两性 内酰胺抗生素阿莫西林

7、则不行 研究发现 通过加人某些相反离子 使其有利沉淀 阿莫西林阴离子与 Zn2 阳离子形成溶解性差的盐 Zn2 离子加入尽管使 内酰胺降解 但使缩 合收率增加至少 30 倍 产品平衡浓度可达 30mmol L 由于热力学控制的酶催化缩合 内酸胺抗生素反应 现阶段缩合收率还较 低 应用价值还不大 2 动力学控制的酶催化缩合反应 此类反应酰基配体需活化 而酰基配体活化一般是形成酰胺类化合物或酯类 化合物 Vroom 报道 将苯甘氨酸 对羟基苯甘氨酸制成相应的酰胺衍生物 在青霉素酰化酶作用下 此酶固定在包含凝胶和由氨基酸组成的多聚体上 酶来 源于 Escherichia coli Acetobact

8、er pasteuri anum Xanthomonas citrii Kluyvera citrophila Bacillus megaterium Alcaligenes faecalis 反应温度 0 35 最适 为 10 pH5 9 合成了头孢氨苄 头孢羟氨苄 氨苄西林 阿莫西林 用此 方法 也可合成头孢拉定 头孢克洛 头孢丙烯 Boesten 等报道 7 ADCA 与 苯甘氨酰胺缩合得到头孢氨苄 并将母核 7 ADCA 从母液中回收 van Doren 报道将底物母核通过 pH 调节 使其达到过饱和浓度 在青霉素 酰化酶 最好固定化 作用下 酶来源 Acetobacter paste

9、rurianuyn Alcaligenes faecalis Bacillus megaterium Escherichia coli Fusarium oxysporum Xanthomonas citri 等 与相应侧链酰胺缩合 得到产品 这种方法比不将底物 母核调到过饱和浓度的转化率高 10 左右 母核与侧链摩尔比不大于 2 5 用此 方法合成了头孢克洛 头孢氨苄 侧链形成酯类化合物中 形成甲酯的较多 Youshko 等报道 6 APA 与侧链 苯甘氨酸甲酯在青霉素酰化酶 ATCC11105 游离态 来源 Escherichia coli 作 用下 合成氨苄西林 青霉素酰化酶催化水溶液中

10、氨苄西林合成主要由初始底物 浓度决定 比较了均相体系中和非均相体系中酶合成反应 在 水溶液 沉淀 非均相体系中 通过形成过饱和溶液进行 然后沉淀产品氨苄西林使得生物催化 过程良好进行 使得氨苄西林转化率由 6 APA 计为 93 最近还有报道 侧链 与多醇 如乙二醇 形成含羟基的酯 再与母核在酶的催化下缩合 转化率高达 99 此方法尤适于头孢丙烯 头孢羟氨苄的合成 在酶法制备 内酰胺抗生素的过程中 一般使用经固定化技术处理得到的 固定化青霉素酰化酶 而早期使用的固定化细胞等形态的酶 因其形态结构和性 能方面的缺陷 目前已不再使用 随着固定化酶技术进步 和对固定化酶在反应 中失活原因的深人研究

11、固定化酶的使用寿命已经大大延长 半数失活 half life 已经达到 50 100 批次 在制备 内酰胺抗生素的酶缩合反应过程中 不可避免地会产生逆反应 水解反应 即反应产物由于酶的作用再逆分解成原料 这对提高反应产率是很 不利的 为提高酶缩合反应的产率 侧链对母核的投料量大大过量 这造成了侧 链的过高消耗 并在产品中引入了不需要的杂质 对生产来说仍是不经济的 MauriZi 报道酶缩合反应制备头孢氨苄 向反应体系中加人少量的酶抑制剂 苯 乙酸 苯氧乙酸 扁桃酸等 可降低酶解作用 同时又不会对酶催化缩合反应 产生太大的影响 从而可以得到较高的反应产率 大大降低侧链的投料量 使侧 链与母核的投

12、料比例降到 2 1 以下 2 2 酶催化氯化反应 酶催化 内酰胺抗生素合成研究 对其酰化缩合反应报道较多 最近 开 始对酶催化氯化反应有研究报道 从微生物 Rathayibacter 种中分离制备对头孢 菌素氯化过氧化物有活性的酶 在 pH6 0 磷酸盐缓冲液中 加人氯化钠和 3 过 氧化氢溶液 此种酶可将廉价的头孢氨苄转为价高的头孢克洛 仅有 Rathayibacter biopuresis 能产生头孢菌素氯化过氧化物酶 现转化率不高 如能 提高转化率 将对头孢克洛的生产产生巨大的影响 2 3 一锅法 酶法研究情况 酶法合成 内酰胺抗生素 一般一步反应在一个反应器中进行 近年来 有人将几步酶

13、法反应 例如水解 缩合或缩合 缩合等 在一个反应器中进行 这 样 不需分离中间体 简化了过程 有利于工业化生产 这将是酶法合成的趋势 之一 Ternadez Lafuente 等报道新型化学酶法合成头孢唑林 通过 D 氨基酸氧化 酶 戊二酰化酶和青霉素 G 酰化酶催化作用 生物转化头孢唑林 以头孢菌素 C 为起始原料 在水溶性中 经三步酶法和一步化学法合成头孢唑林 不分离纯化 中间体 每步酶法收率接近 100 先将头孢菌素 C 酶法脱乙酰基 然后由 DAO 和 GA 催化 再由 PGA 固定化酶 来源 Esherichia coli ATCC11105 进一步催化 酰化 7 ACA 得到 7

14、1H 四氮唑 乙酰氨基 3 乙酰氧甲基 3 头孢烷酸 最 后与 MMTD 侧链化学法缩合得到头孢唑林 Wegman 等报道 自苯甘氨酸腈二步酶法转化 一锅法制备头孢氨苄 腈 水解酶 来源 R rhodochrous 催化水解 D 苯甘氨酸腈为酰胺 然后在青霉素 酰化酶 E C 3 5 1 11 作用下 7 ADCA 与 D 苯甘氨酰胺缩合 得到头孢氨苄 然后将 1 5 二羟基萘加至反应液中 与头孢氨苄一起结晶 这使得反应液头孢 氨苄浓度很低 避免了水解 收率 79 合成 水解比 7 7 研究还显示 D 苯甘 氨酸腈对青霉素 G 酰化酶有明显选择抑制作用 Schnien 等报道己二酰 7 ADC

15、A 水解和头孢氨苄酶法合成一锅法完成 所用 酶为固定酰胺化酶 来源 Escherichia coli 缩短了头孢氨苄制备过程 酶水解 苯甘氨酸酯或酰胺 己二酰 7 ADCA 7 ADCA 头孢氨苄 青霉素酰化酶 3 产品的分离与纯化产品的分离与纯化 在酶法制备 内酰胺抗生素的技术中 产品的分离及纯化是一项关键性技 术 由于所用原料侧链 母核和产品的理化性质相近 采用普通方法难以达到分 离提纯的目的 因此该问题一直是酶法合成 内酰胺抗生素生产的一大障碍 目前使用的回收纯化方法有多种 如 酸碱结晶法 浓缩结晶法 化学法 如萘 复合物法 柱色谱法 纳米滤膜法 两相萃取法等 这些方法各有优缺点 还 需

16、进一步的改进和完善 采用酸碱结晶法分离产品 可以不用有机溶剂 避免了 对环境的污染 但是此法不能把产品一次分离干净 母液中残留的产品仍需浓缩 结晶或其他方法加以回收处理 而且产品纯度也不够理想 利用头孢菌素与萘类化合物形成复合物的方法比较简单可行 反应体系中的 产品几乎可以定量地与萘类化合物形成复合物 从而得到完全分离 此法非常适 合有酶存在的反应体系 如能解决回收萘类化合物的问题 这将是一个非常好的 分离纯化工艺 Wegman 等报道一锅法制备头孢氨苄 将 1 5 二羟基萘加至反应液 与头 孢氨苄一起结晶 这使得头孢氨苄浓度很低 避免了水解 收率 79 Schroen 等报道 在酶法合成头孢氨苄过程中 同时将产品通过与萘类衍生 物形成复合物 这些复合物易结晶 复合物为复合剂与头孢氨苄按一定比例组成 复合物的形成利于防止不需要的水解 优化了反应条件 pH7 5 温度 25 为最 适宜条件 讨论了产物形成复合物对反应的影响 在大多情况下 有好的影响 水解被抑制 特别是复合剂为 1 5 二羟基萘 酶为液态酶 这样可得到高浓度 的头孢氨苄 采用两相萃取法分离提纯产品 是一个较好方法 Hern