《【最新】酶工程文档》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新】酶工程文档（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一章 酶工程基础 一酶的催化特点（一）酶和一般催化剂的共性：1、用量少而催化效率高；2、它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。3、酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。（二）酶催化作用特性：1、高效性；2、专一性；3、调节性1 高效性：酶加速反应的机理是降低反应的活化能。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。2专一性：又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性。3调节性：1. 酶浓度的调节 2 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调
2、节第 2 节 酶的活力测定1、 酶活力与酶促反应速度酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量单位：浓度/单位时间2、酶的活力单位（U）1 国际单位（IU 单位）：在最适反应条件下，每分钟催化 1umol 底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU） ， 1 IU = 1umol /min1 单位催量（Katal, Kat 单位）：在最适反应条件下，每秒钟催化 1mol 底物转化为 产物所需的酶量，称 Kat 单位。1 Kat=1mol/s=60mol/min=6X 107 IU3、酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：
3、U/mg 蛋白质。酶的比活力=酶活力单位/mg（蛋白质或 RNA）酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。酶提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。酶的纯化倍数： 酶的回收率： 100%第 3 节 酶反应动力学1、米氏方程：反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即氏方程Km 即为米氏常数，Vmax 为最大反应速度1. Km 值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是 mol/L。2. Km 可近似表示酶对底物的亲和力； 当 K2 K3 时， Km Ks 3.Km 是酶的特征性常数之一一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。米氏方程的意义：1 米氏常数为反
4、应速度是最大反应速度一半时的底物浓度，Km 单位为摩尔浓度（mol/L）2Km 对于特定的反应条件而言是一个特征常数。它只与酶的性质有关而与酶的浓度无关，不同的酶，具有不同的 Km 值。3Km 值作为常数只是对固定的底物、一第 一 步 总 活 力每 一 步 比 活 力 第 一 步 总 活 力每 一 步 总 活 力VmaxVSKmVmax/2 =Kmk132+定的温度、一定的 pH 等条件而言的。 4Km 值表示酶与底物之间的亲和程度：Km 值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km 值小表示亲和程度大,酶的催化活性高，因此可以判断酶的最适底物。5 催化可逆反应的酶正逆方向反应的 Km 是不相同
5、的，测定细胞内 Km 和正逆方向反应的底物浓度，可大致推测正逆反应的效率，判断酶在细胞内的催化的主要方向.4. Vmax：Vm 是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3 E如果酶的总浓度已知，可从 Vmax 计算酶的转换数(turnover number) ，即动力学常数 K3。第二章 酶的发酵工程 1.诱导 (1)组成酶：细胞固有的酶类。 (2)诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。1. 酶合成的诱导:加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。
6、实验：(1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。2.阻遏:(1)分解代谢物阻遏 (2)反馈阻遏2.末端产物阻遏:由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3 分
7、解代谢物阻遏(1)指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。(2)分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。第三节 酶发酵动力学 一、细胞生长动力学:在分批培养过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期 5 个阶段。营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod 模型:比生长速率（1/h） （specific growth rate）max：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长
8、限制基质浓度） 克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L二、产酶动力学 （1） 酶生物合成的模式根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为 3 种模式，即：生长偶联型 同步合成型; 中期合成型部分生长偶联型延续合成型非生长偶联型 滞后合成型1. 生长偶联型（又称同步合成型）:酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA 很不稳定。生长偶联型中的特殊形式中期合成型:酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合
9、成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的 mRNA 是不稳定的。2.部分生长偶联型（又称延续合成型）: 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的 mRNA 相当稳定。SKXdtsm1a 酶细 胞细胞或酶浓度 时 间 0246810.10.2.30.4.5 细 胞 浓 度酶 浓 度细胞浓度 (OD5)酶浓度U/mL时 间 (h)b酶细 胞 细胞或酶浓度 时 间 0408012020406 (/ml) (h) .012.5.037.50.(g/L) 3. 非生长偶联型（
10、又称滞后合成型）:只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的 mRNA 稳定性高。酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。同步合成型：提高对应的 mRNA 的稳定性，如降低发酵温度 。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高 mRNA 稳定性以及解除阻遏两方面努力。(二) 产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：式中 X细胞浓度(g /L) 细胞比生长速
11、率(h-1） 生长偶联的比产酶系数(IU/g) 非生长偶联的比产酶速率 (IU/(g h) E酶浓度(IU/L) t 时间(h)生长偶联型部分生长偶联型 非生长偶联型第三章 酶的分离工程3.1 酶的提取、分离纯化技术路线（预处理）细胞破碎（动物,植物或微生物细胞）（粗粉级分离）酶提取（发酵液） （细分级分离）酶分离纯化（离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等）（成品加工）酶浓缩酶贮存酶分离纯化不同阶段：酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1) 粗蛋白质 : 采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2) 部分纯化: 初步的
12、纯化，使用各钟 柱层析法。(3) 均质酶: 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。c酶细 胞细胞或酶浓度 时 间 0204060801203405 酶 浓 度细 胞 浓 度细胞浓度 (g/L) 时 间 (h)1203405酶浓度 (U)XdtXdtEtdt 第四章 固定化酶与固定化细胞第 1 节 概述固定化细胞技术： 二 固定化酶的优缺点优点：多次使用；可以装塔连续反应；纯化简单；提高产物质量；应用范围广缺点：首次投入成本高；大分子底物较困难1 一般方法及特点1 四大类方法：吸附法（包括电吸附法） ；结合法（无机多孔材料） ；交联法（双功能试剂） ；包埋法（微胶囊法） 各类固定
13、化方法的特点比较: 2 选择方法依据：（1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方法的选择（1） 吸附法 1 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。2. 常用载体：（1）无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg 蛋白/克吸附剂（2）有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷比较项目 吸附法 结合法 交联法 包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合 制备难易 易 难 易 较难 较难固定化程度 弱 强 中等 强 强活力回收率 较高 低 高 中等 高载体再生 可能 不可能 可能 不可能 不可能费用 低 高
14、低 中等 低底物专一性 不变 可变 不变 可变 不变适用性 酶源多 较广 广泛 较广 小分子底物、药用酶（二）结合法 1. 离子键结合法 2. 共价键结合法1. 离子键结合法：酶分子与载体之间以离子键作用而实现结合的固定化方法常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度2 .共价键结合法：酶分子与载体之间以共价键作用而实现结合的固定化方法（2） 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基，甲硫基， 吲哚基，二硫键（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体4）载体活化的方法：A重氮法 B叠氮法 C烷基化反应法 D
15、硅烷化法 E溴化氰法（三）交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。用处：可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。（三）交联法的形式：（1）酶直接交联法（2）酶辅助蛋白交联酶直接交联法： 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。影响因素：固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液 pH 和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质.双重固定法：（1） 吸附交联法（2） 交联包埋法（1） 吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。（2）交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。优点：这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。（四） 包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法分为网格型和微囊型1网格型：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。2微囊型包埋法：是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成
