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1、 结核病实验室诊断现状 主要内容 一 患者发现二 结核病控制对实验室的要求三 结核病实验室诊断现状四 结核病实验室存在的问题五 结核实验室诊断的主要难题六 十二五结核病实验室建设 结核病难上加难 筛查 诊断 确诊难 PPD医学检验X线临床症状 传染 传播性强 呼吸道飞沫传播1人 10 15人 并发症 合并症 糖尿病艾滋病 发现难症状隐匿 多样 早期症状轻微 易漏诊咳嗽 咳痰 低热起病缓慢 病程长 全程难 治疗难耐多药肺结核 结核病流调 疫情显示 结核病疫情特征 人群筛查 缺少可靠的实验室筛查技术 菌阴占多数 菌阴肺结核患者多 临床诊断 临床诊断难度加大 无症状 无症状患者比例明显增加 结核病难
2、上加难 一 患者发现 2012年全国结防机构登记活动性肺结核患者894199例 登记率66 37 10万 涂阳患者358149例 占40 05 登记率为26 58 10万 涂阴患者508620例 占56 88 未查痰2073例 占0 23 结核性胸膜炎25357例 占2 84 与2011年相比涂阳减少65681例 涂阴增加53960例2012年登记的耐多药肺结核患者共2731例 患者发现 2012年全省结防机构登记活动性肺结核患者47334例 登记率82 70 10万 涂阳患者21339例 占45 08 登记率为37 28 10万 涂阴患者25731例 占54 36 未查痰 12例 占0 03
3、 结核性胸膜炎252例 占0 53 与2011年相比涂阳减少4812例 涂阴增加5427例2012年湖北省登记耐多药肺结核患者210例 患者发现 据WHO估算 每年新发MDR TB患者50万 XDR TB5万 目前检测到的耐多药结核病病例仅占全球负担的5 广泛耐药结核病 XDR TB 则更低依据我国第5次结核病流行病学调查结果 我国结核病患者中涂阳患者占14 4 118 1310 菌阳 涂阳或培阳 患者占26 5 347 1310 菌阴患者占73 5 963 1310 根据07 08耐药监测结果估算 我国每年新发MDR TB患者12 1万 XDR TB1万提示虽然实验室发现了大量患者 但诊断技
4、术与能力仍然缺乏 二 结核病控制对实验室的要求 结核病正确诊断是发现 治疗和管理结核病患者的基础 实验室诊断起着重要的作用 特别是细菌学诊断WHO1995年把DOTS策略作为全球结核病控制策略 肺结核症状可疑者使用痰涂片检查发现传染性患者是DOTS策略5要素之一2005年提出的遏制结核病策略 仍然将采用细菌学方法发现患者作为要素之一 并提出协作研发新型诊断技术 对实验室的要求 当前 抗酸菌涂片镜检 结核分枝杆菌分离培养和药物敏感性试验等常规方法仍然是发达国家和发展中国家细菌学诊断的主要方法 它不仅是发现传染源的最主要手段 也是确诊结核病 选择治疗方案 考核疗效以及评价防治效果的可靠指标 对实验
5、室的要求 目前的常规实验室方法虽各有长短 但总体上仍不能满足结核病诊断的要求 快速 准确 简便和低廉的实验室诊断技术一直是人们不知疲倦追求的目标 特别是 近年来人们将控制潜伏性感染或是临床前期感染作为控制结核病的早期策略之一 这些对实验室工作提出了较高的要求 对实验室的要求 在发达国家 由于结核病疫情低 具有特征性的持续咳嗽 发热等症状已经不再是疑似结核病的可疑症状 在这些国家需要 能够在高危险人群中确定潜伏性感染的方法能够替代x线光片和痰涂片来发现移民和其他高感染风险人群中活动性结核病的措施能够替代传统培养方法的早期诊断手段能够快速便捷的区别医源性感染和社区获得性感染的指纹分析手段能代替生化
6、方法来进行菌种鉴定的新技术 对实验室的要求 在发展中国家 尤其是结核病高负担国家 结核病暴露史已经很难进行确定和评估 一些免疫学方法也在实验室诊断中起着一定的作用 如血清学方法 但是 广泛的卡介苗 BcG 接种和HIV感染影响了一些血清学方法的特异性 对于寻找快速 可信 简便的方法来替代现行的涂片显微镜检查的需求不很迫切 这些国家的需要倾向于 较传统培养方法更敏感 快速 简便的手段来诊断涂阴肺结核和无症状的结核病患者在耐药结核病高流行国家需要快速 可靠 廉价的方法来发现耐药结核病患者在HIV感染者中简便的筛查结核病患者的方法 三 结核病实验室诊断现状1 发达国家的结核病实验室诊断现状 涂片常规
7、镜检 分离培养和药物敏感性试验仍然是大多数发达国家临床实验室诊断技术的主流与此同时一些快速诊断技术如基于液体培养的方法 核酸杂交 16s核糖体基因的测序 应用HPLc对细胞壁脂质 分枝菌酸 的分析 核酸扩增检测 NAAT 以及荧光原位杂交和噬菌体生物扩增技术等方法也成为他们的常规方法免疫学检测方法也取得不错的结果 特别是 干扰素释放试验在发达国家得到了较广泛的应用测序技术在药敏检测中得到应用 1 发达国家的结核病实验室诊断现状 基因分型技术在发达国家被广泛使用 主要方法有 限制性酶切片段长度多态性 IS6110一RFLP 数目可变的串联重复序列 VNTR 分枝杆菌散在重复单位分型 MIRU 间
8、隔区寡核苷酸分型 Spoligotyping 单核苷酸多态性分析 SNPS 长片段多态性 LSP 以及缺失图谱等方法在一定条件下可以追溯和确定传染源 鉴别未知传播 发现和鉴别培养的假阳性 2 发展中国家结核病实验室诊断现状 从全球来看 结核病的高负担国家主要集中在发展中国家 由于经济发展程度所限 已经被使用了百余年的痰涂片显微镜检查技术和分离培养技术仍然是发展中国家结核病实验室诊断体系中所采用的主要方法尽管痰涂片显微镜检查在HIV高流行地区其灵敏度不是很高 但是其简便 价廉并能够检测出传播意义更为重要的排菌患者wHO在发展中国家仍然推荐使用涂片镜检作为结核病控制规划中患者发现的基本手段 在这些
9、国家 只是在少数地区的实验室能开展分离培养和药物敏感性试验等 3 我国结核病实验室诊断现状 我国结核病实验室诊断体系已经建立多年 总体上由三部分组成第一 国家 省 地市和县级结核病控制体系中的实验室 对结核病控制工作做出了重要贡献 在体系中地市 县结核病实验室 包括近两年出现的定点医院实验室 当前以涂片镜检为主要技术手段 部分县市开展了培养 部分地市开展了药敏和分子生物学快速诊断技术 我国结核病实验室诊断现状 第二 结核病专科医院的临床细菌学实验室 开展涂片镜检 分离培养和药物敏感性试验等较为全面的细菌学方法 也能采用快速培养 分子生物学技术及免疫学检测技术对于一些特殊病例进行鉴别诊断第三 综
10、合医院中的结核病实验室 很少有 很少开展或不常开展细菌学检查 多采用一些可靠性不高的免疫学检测进行实验室诊断 新型检测技术应用情况 1 设备配备情况 设备配备情况其他达米恩项目 为贵州贵阳 青海西宁地市级及所辖县区配备LED荧光显微镜梅里埃项目 为广西柳州 新疆喀什地市级及所辖县区配备LED荧光显微镜省级经费 液体培养自动化检测系统 北京 上海 河南 浙江等LED荧光显微镜 湖北 山东 浙江等基因芯片 湖北 新型检测技术应用情况 2 新型检测技术应用情况 3 关于Hain和基因芯片的建议 适用于地区及以上级实验室仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测操作需要至少有3个独立的实验室以避免
11、交叉污染仅能检测MDR XDR的检测仍需要依靠传统药敏试验可以独立作为MDR的诊断工具对于MDR病人 仍需要传统的培养 固体或液体培养 检测治疗效果 培养阴转 临床报告必须取得省级临床检验中心颁发的 临床基因扩增实验室 许可证建议的覆盖面 每50 100万人口至少需要1个LPA实验室或基因芯片实验室 就我国目前实际情况100万人口地市的级建立一个相应实验室是可行的 XpertMTB RIF 检测结核分枝杆菌检测利福平耐药直接标本检测100分钟可获得结果 WHO关于XpertMTB RIF的建议 XpertMTB RIF应该用于怀疑MDR TB的病人 以及HIV合并结核的病人的最初诊断 强烈推荐
12、 XpertMTB RIF在MDR或HIV问题不十分严重的地区 可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测 特别是用于涂阴标本的进一步检测 根据具体情况推荐 需考虑当地的资源 说明 WHO在 2011年全球结核病控制报告 中对该试剂的评估结论为 单次XpertMTB RIF检测可检出99 的涂片阳性 简称涂阳 和 80 的涂片阴性 简称涂阴 肺结核病患者 但有文献报道 单次XpertMTB RIF检测涂阴培阳样本的检出率分别为72 5 和76 9 由于涂阴患者包括涂阴培阳 涂阴和培养阴性 简称培阴 两种类型 而涂阴培阴患者的检出率必然低于涂阴培阳患者 因此 该报告中XpeftMTB RIF的MT
13、B涂片阴性患者阳性检出率较实际值偏高 说明 涂阴特别是涂阴培阴患者的诊断有进一步探讨的必要 根据该检测试剂公开发表的数据 该试剂的敏感度研究均以培养或涂片阳性作为判断标准 涂阳培阳样本检出率为99 8 培阳样本的检出率也高达90 具有高敏感度 根据我国第5次结核病流行病学调查结果 以我国痰菌阳性 简称菌阳 患者占患者总数26 4 进行推算 该试剂的理论检出率仅为23 7 我国结核病涂阴培阴患者占患者总数的73 6 说明 XpertMTB RIF适用于痰标本 包括去污染后的痰标本 肺外标本应用XpertMTB RIF的研究十分有限 增加检测次数可能会增加XpertMTB RIF的敏感性 但是需要
14、考虑资源情况上述建议也适用于儿童不能取代传统的涂片检查 培养和药敏试验 治疗监测 流行病学调查 其他一线药物以及二线药物的药敏试验 在MDR低风险组 如新病人 XpertMTB RIF检测结果为利福平耐药者 建议用传统药敏试验或LPA进行确认 新检测技术验证评估与应用完成评估国产环介导核酸等温扩增试剂盒 新型检测检术应用情况 4 其他正在开发或评估的新技术 分子水平 线性探针杂交 LiPA 基因芯片法 Genechip 多重连接再扩增 MLPA 变性高效液相色谱 DHPLC 质谱 MALDI TOFMS 焦磷酸测序 Pyrosequencing 实时PCR Real timePCR 线性探针
15、V2 多色巢式荧光定量 GenXpert 分子诊断技术 免疫学诊断 结核菌素试验 用于流调 卡介苗接种 筛查 临床诊断与鉴别诊断 但PPD有多种分枝杆菌的蛋白成分 因而特异性差 且结果观察不便结核抗体测定 结核抗原测定 能早期检测 技术简便快捷 但难以获得高特异性的抗体 目前尚缺乏结核抗原检测试剂细胞因子检测 免疫学诊断 结核抗体测定 结核分枝杆菌感染机体 患者或有特异性IgG IgM IgA形成 联合检测可提高灵敏性优点 简便快速 有一定的敏感性和特异性 对结核病的诊断与鉴别诊断有参考价值缺点 假阳性较高 没有单一抗原被所有患者识别 总的来说 结核病患者的抗体反应是不完全相同的 要求设计一个
16、由多种抗原组成的鸡尾酒式的结核病血清学诊断试验 具有灵敏度高和特异性强的结核病血清学诊断试剂要求由多种抗原的混合体构成因此以后的研究方向是筛选各种特异性强 灵敏度高的抗原组成混合抗原 研制结核病血清学诊断试剂 有很多研究者已经进行或正在进行这方面的研究 相信在不久的将来这种研究成果可以应用于临床 服务于结核患者 免疫学诊断 1个决定性因素 抗原 特异性 灵敏度潜伏 感染初期活动性肺结核 脂阿拉伯甘露聚糖 LAM 抗原敏感性63 特异性92 4 作为属特异性抗原的脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成 拥有较强免疫原性与免疫调价的功能 能刺激机体促进相应抗体产生 故可作为为结核病血清学诊断抗原 应用较广泛 对活动性肺结核患者的检测敏感性为63 0 特异性达92 4 提示LAM抗体检测不失为一项结核病辅助诊断的有效方法 U1蛋白 早期 特异性 U1蛋白 UrineProtein1 为Mukherjee等收集结核分枝杆菌H37Rv株静脉感染C57BL 6小鼠早期 10 14天 尿液中分离得到的结核抗原 经氨基酸测序鉴定后 克隆表达获得可溶性重组蛋白 分子量约为16 8KDa 以ELISA
