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1、1生化实验报告山楂原花色素的提取一 实验目的1. 了解并掌握从山楂中制备原花色素的方法。二 实验原理原花色素（也称原花青素） （proanthocyanidins）是一类从植物中分离得到的在热酸条件下能产生花色素的多酚化合物。它既存在于多种水果的皮、核和果肉中，如葡萄、苹果、山楂等。也存在于如黒荆树、马尾松、思茅松、落叶松等的皮和叶中。原花色素属于生物类黄酮（flavonoids） ，它们是由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成，最简单的原花色素是儿茶素的二聚体，此外还有三聚体，四聚体等。依据聚合度的大小，通常将二至四聚体称为低聚体，而五聚体以上的称为高聚体。从植物中提取原花色素的方法一般有两种
2、，分别是用水抽提或用乙醇抽提。其抽提物为低聚物，称之为低聚原花色素（oligometic proanthocyanidins，简称 OPC） 。生理功用：1.最好的心脏保护剂，抵御引发心血管疾病的诱变因素的冲击。2.强化血管，有消肿化瘀的功效。减少毛细血管的阻力和改善渗透性，使细胞更容易吸收养分与排除废物。3.高效抗氧化能力。清除氧自由基的能力比其他天然抗氧化剂如胡萝卜素、维生素 C 和 E、儿茶素等强很多。4.产生组胺的抑制剂，减轻炎症。抗过敏皮肤保健、抗衰老。利用低聚原花青素溶于水的特点，用热水煮沸抽提原花青素，再用大孔吸附树脂吸附、洗脱得到原花青素。D-101 树脂是一种球状、苯乙烯型、
3、非极性交联聚合物吸附剂，具有相当大的比表面积和适当的孔径，对皂苷类、黄酮类、生物碱等物质有特殊的选择性，适用于从水溶液中提取类似性质的有机物质。2三 实验器材1. 新鲜山楂（或山楂片） ，市售。2. 烧杯。3. 高速组织粉碎机。4. 玻璃层析柱 1.5cm*20cm。5. 大孔吸附树脂 D-101。6.电磁炉。7. 不锈钢锅。8.双层纱布。四 实验试剂1、95% 乙醇（实验室提供） 。2、60% 乙醇：取 95%乙醇 60ml，加入蒸馏水，使体积达到 95ml。五 实验操作1.称取山楂干 6.00g，剪成块状，置于锥形瓶中，加入 40ml 蒸馏水，沸水浴45min，间期混匀。冷却后加入 20m
4、l 蒸馏水，用脱脂棉或双层纱布过滤，滤液备用。2.取一根层析柱（1.5cm*20cm） ，洗净，竖直装好，关闭出口，加入蒸馏水约1cm 高，用烧杯取一定量已处理好的大孔吸附树脂 D-101，搅匀，沿管内壁缓慢加入，待柱底沉积约 1cm 高时，缓慢打开出口，继续装柱至高度 12cm（液面高于树脂 34cm） 。3.平衡：用蒸馏水洗 2 倍柱床体积（20ml） ，控制流速在 2ml/min 左右，至流出液 pH 值显中性。4.滤液上样，上完样后，先用蒸馏水洗 2 倍柱床体积，然后换 60%乙醇进行洗脱，控制流速在 1ml/min。待有红色液体流出后开始收集，直到收集到无红色为止。5.将洗脱液用 6
5、0%乙醇定容至 100ml，贴好标签后置于 4 摄氏度冰箱中，留待下次实验。六 注意事项31、实验前应检查层析柱是否完好，有无堵塞或漏气现象。2、装柱要求连续、均匀、没有气泡和断纹，液面不得低于树脂表面，否则需重新装柱。3、洗脱时流速不宜过快。七 实验记录取用山楂干质量：6.07g原花色素的测定一 实验目的1. 掌握盐酸-正丁醇比色法测定原花色素的院里和方法。二 实验原理紫外分光光度法：利用原花色素在波长 280nm 处具有最大吸收的特点。该方法简便易行，但提取物成分多样，标准难定。香草醛检测法：原花色素在酸性条件下，其组成单元儿茶素的 A 环上的羟基和香草醛发生缩合反应，在浓酸作用下形成的产
6、物变为有色的正离子。铁盐催化比色法；薄层层析法；HPLC 法；HPLC-MS 质谱法原花色素（I）的 48 连接键很不稳定，易在酸作用下打开。反应过程（以二聚原花色素为例）是：在质子进攻下单元 C8（D ）生成碳正离子（II ） ，48键裂开，下部单元形成（-）-表儿茶素（III ） ，上部单元成为碳正离子（ IV） ，失去一个质子成为黄-3-烯 -醇（V） ，在有氧条件下失去 C2 上的氢，被氧化成花色素（VI） ，反应还生成相应的醚（VII） 。若采用正丁醇溶剂可防止醚的形成。 三 实验器材1. 试管 1.5cm*15cm（*9） 。2. 烧杯、量筒。3. 722 型分光光度计。4. 吸管
7、。5. 电磁炉。6. 不锈钢锅。4四 实验试剂1、1mg/ml 原花色素标准品：准确称取 10.0mg 原花色素标准品用甲醇溶解，于10.0ml 容量瓶定容至刻度。2、HCl-正丁醇：取 5.0ml 浓 HCl 加入 95.0ml 正丁醇中混匀即可。3、2% 硫酸铁铵：称取 2.0mg 硫酸铁铵溶于 100.0ml 2.0mol/L HCl 中。4、试样溶液：上次实验配制得到（1.03.0mg/ml） 。五 实验操作管号试剂/ml0 1 2 3 4 5 6 7样品8样品OPC 标准液0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.1 0.2甲醇 0.5 0.45 0.40
8、0.35 0.30 0.25 0.20 0.4 0.32%硫酸铁铵0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10HCl-正丁醇3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40沸水浴 20min 取出，冷水冷却 15min 后测定OPC 含量/g0 50 100 150 200 250 300A546nm 0 0.171 0.383 0.451 0.410 0.676 0.633 0.382 0.509六 数据处理1、以标准 OPC 含量（g）为横坐标，A546nm 吸光度为纵坐标绘制标准曲线。由样品的吸光度查算出样品液的 OPC 含量。2、由收集液的体积和所测浓度计算山楂中的 OPC 百分含量。5
