《【最新】色谱技术答案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新】色谱技术答案（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1、 若想建立某中药的醇提取液的 RPHPLC 指纹图谱，是采用等度洗脱还是梯度洗脱？简述其分析条件的优化思路。（1） 采用梯度洗脱由于中药的醇提取液成分复杂，样品的容量因子范围窄，不能用等度洗脱。梯度洗脱可以使不同容量因子的样品成分在洗脱时随流动相的连续改变而趋于同一 k值，谱峰尖锐而对称，分离度改善，缩短分离时间，降低最小检测量和提高分离度精度，从而让所有成分均出峰。（2） 优化思路梯度洗脱期间，强溶剂的浓度增大，优化梯度条件有起始浓度，终止浓度，梯度时间t 和溶剂的种类。因此在 RPHPLC 指纹图谱建立时，要考虑流动相的种类，流动相梯度范围和梯度斜率三方面。A、流动相种类的选择： RP
2、HPLC 指纹图谱中常用甲醇、乙腈、四氢呋喃等有机溶剂与水混合，流动相种类由样品分离难易程度决定。甲醇、乙腈、四氢呋喃洗脱强度逐渐增高，样品易分离时用二元溶剂系统，不易分离时采用溶剂优化法选择流动相和水的最佳比例，调整 k值，使其在 120（t R：3-35min） 。B、梯度范围：即起始浓度和终止浓度，一般为 5%-100%（t R：30min ） ，若谱图前段空白可提高初始浓度，末端空白可降低终止浓度，可节约时间，缩小梯度范围使所有组分短时间从柱中洗脱出来。C、梯度斜率：根据初步分离的谱图，峰密集部位可降低斜率，减小强溶剂浓度变化速度，峰疏散部分提高梯度斜率，时间短。2、 根据 Van D
3、eemter 方程在 HPLC 中的表现形式，分析在 HPLC 中影响柱效的因素及实验条件的选择。（1）影响柱效的因素： 物流扩散项：为避免物流扩散而引起峰扩张，需用小儿均匀颗粒填充色谱柱。 纵向扩散项：HPLC 中 Dm 仅有气相的 10-410-5 倍，该项可忽略。 固定相传质阻力项：降低固定液膜厚度，加快组分在固定相中的扩散。 流动相传质阻力项：组分分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的部分分子流速较慢，中央分子流速较快，而引起峰扩张需要降低该项，需减小 dp 和 u，增大 Dm. 流动相滞留传质项：固定相的多孔性使部分流动相滞留于固定相某一局部，流动相中组分分子必须自流动相扩散到滞
4、留区，才能与固定相进行质量交换。为降低该项，应采用颗粒小，微孔浅，孔径大的固定相。（2）选择实验条件以提高柱效：减小填料空穴深度；减小填料粒度；用低粘度溶剂作为流动相；流动相采用低流速；uDdfCudpuDdpC uDdfkqpkWuCuAHHsmsm smssme 222 22222 1130适当提高柱温。3、 简述在无参考文献的情况下，优化建立某试样 RPHPLC 等度分离条件的思路。建立试样的 RPHPLC 等度洗脱分离的关键步骤是优化流动相，使各组分达到基线分离。（1） 优化流动相对于 RPHPLC 来说，常用流动相是甲醇、乙腈、四氢呋喃与水的配比混合物。对于三角形优化法将此三种强溶剂
5、作为三角形的三个顶点，并用水相将三种溶剂调为同一强度，确定此三个系统后，根据两两 1:1，三者 1:1，又可确定其余四种流动相系统，根据这七种流动相配比，分别进行 RPHPLC 实验，得到 7 种结果，从中选出一种适合该样品的流动相。若不用三角形优化法，可选用强溶剂以 20%的浓度递减，分别作 RPHPLC，从中选出合适的溶液强度，使 k在 120（t R:30-35min） 。（2） 流速和柱温的控制：在 RPHPLC 中，流速一般用 10m L/min，如果分离度不好，可以适当减小流速，柱温多控制在 3040，不可超过 40，否则会损坏柱子，若温度过低，可适当提高柱温。4、 简述离子对色谱
6、的原理和反相离子色谱对色谱中影响保留值的因素。（1） 离子对色谱的原理：通过加入合适的反离子，同离子化的试样形成离子对，这种离子对复合分子同中性或非极性分子一样，从而有可能采用分配色谱法进行分离。 （这里有个关系式）试样离子和反离子均易溶于水相，而离子对具疏水性，因而被非极性固定相提取。组分离子性质不同，离子对极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而各离子先后离开色谱柱。（2） 反相离子对色谱中影响保留值的因素： 离子对试剂：其疏水性越强，在非极性固定相上的溶解度越大，则保留值越大，平衡离子浓度增大，利于离子对形成，保留值随之增加。 溶剂强度：流动相中水比例减少，有机溶剂增加，溶剂
7、强度增加，k值减小。 pH 的影响：取决于溶质的性质，溶质电离强度减小将使保留时间变小。 离子强度：随平衡离子外，若流动相中还存在其他辅助离子，则使离子强度增加，组分保留值下降，离子强度加倍，保留值大致变化 23 倍。5、 试分析影响分离度的因素及提高分离度的措施。（1）分离度是衡量分离效果的指标，基本分离方程：分离度受动力学和热力学因素两方面的影响，因素有：效率因子 n，选择性因子 ，容量因子 k。1） 、效率因子(n)：当固定相确定以后，要使一对组分的分离达到某一分离度，柱必须具有最低限度的理论塔板数(最小柱长 )，增加柱长可以提高分离度，减小柱的 H 可以提高分离度，比增加柱长更可取。2
8、） 、容量因子(k)：容量因子(k) 增加，Rs 增加。K合适的范围：120。使 k改变的方法有；改变柱温；改变流动相性质及组成(在液体色谱中) ；改变相比。3） 、选择性因子()： 越大，柱选择性越好，越能获得良分离。三个参数中， 的增加对分离度的提高最有效。改变方法：改变固定相、改变流动相、改变柱温、改变样品结构衍生化，使 增大，提高分离度。在液相色谱中，由于固定相对于流动相体积而言很小，溶质在固定相中的量亦很少，k很小，当 k增大时 R 也迅速增加， k可通过控制溶剂极性大小调节。（2）提高分离度的措施：1）改变流动相的组成：增加 。)1(4kRs2）改变流动相的 pH：限用于样品为能电
9、离的酸或碱。3）改变固定相：因需换色谱柱、流动相，使 k、 在合适范围，不方便。4）改变分离温度：升高温度，k值减小，可减少溶剂洗脱能力来抵消此效应。5）采用各种配位反应：提高分离的选择性。6、影响薄层展开的因素有哪些？如何影响的？） 相对湿度 展开时，最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，随溶质、溶剂极性的增加，相对湿度范围也增大。 例如： 在用苯作展开剂时，适宜的相对湿度范围很窄 在用乙醚作展开剂时，适宜的相对湿度范围 2050 在用氯仿-异丙醚-25氨水（45:45:10）作展开剂时，适宜的相对湿度范围 2080 因为展开室中展开剂蒸气分子有取代吸附在薄层上的水分子的趋势，取代量决定于
10、展开剂蒸气的极性和量；展开剂蒸气分子极性越大，越易取代吸附的水分子，使原吸附的水分下降，使薄层上吸附的水蒸气的影响越小。 记录相对湿度 控制相对湿度 A硫酸溶液法：双槽展开缸的一侧加入适当浓度的硫酸 B无机盐饱和溶液法 ） 溶剂蒸气 展开室饱和有以下情况 A展开室饱和：展开剂蒸气在展开室中达到平衡 B预吸附：薄层板干燥板面对展开室气体分子的吸附 C吸附饱和：薄层板干燥板面与展开室饱和气体空间达到平衡 D毛细管饱和：薄层板所有的自由空隙借毛细管作用被溶剂充满的过程，即相当于展开后薄层的状态 “边缘效应” 薄层边缘处低极性溶剂挥发快，因此边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf 值相应增大 “脱
11、混”、 “双前沿” 未饱和展开时，吸附剂对多元展开剂的亲和力不同，展开剂的上升速度不同（亲和力 ABC，则 Rf 值 ABC） 当展开剂极性差异较大时，产生“双前沿”） 温度 温度对纸色谱影响较大 对 TLC 影响较小） 展开形式及展开条件同样影响分离度） 展距的影响PC ：2030cm ；TLC：1020cm； HPTLC：510cm6）.展开室的放置：水平、稳定、避免阳光直射，不要通风，离开热源，光敏物质的分离要置于暗处 7、简述气相色谱分析中，固定相选择的原则。色谱柱(固定液)的选择原则：最难分离的物质达到要求的分离度，且分析时间适宜。 当样品组分已知时，采用“相似性原则”原则选择固定液
12、 按极性选择 非极性组分非极性固定液，组分按沸点顺序出柱，低高（色散力） 中等极性组分中等极性固定液（色散力、诱导力）基本按沸点出柱，对沸点相同的极性、非极性组分，诱导力起主要作用，非极性先出柱 强极性组分强极性固定液，按极性顺序出柱（定向力） 按化学官能团选择 当所选固定液分子具有与组分分子相同的官能团时，相互作用力最强，选择性高。 按主要差别选择 若组分主要差别是沸点，选非极性固定液 若组分主要差别是极性，选极性固定液当样品组分性质未知时：用不同极性高效毛细管柱分离尝试法：选择极性等级不同的色谱柱，先用中等极性，再用弱极性，若分离改善再用非极性，若分离破坏，用极性或强极性。8、简述 HPLC 中可能造成色谱峰拖尾的原因及采取措施。 “坏”柱 “污物”在柱进口中处堆积 样品超载 样品的溶剂不对 柱外效应 化学或次级 保留（硅羟基）效应 缓冲不足或不合适 重金属污染
