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1、1缺血预适应抗脑缺血再灌注后神经元凋亡的机制( 文献综述 )专业：生理学姓名：董印 （9917028）班级：99 级临床医学七年制专业导 师：陈连璧教授（山东大学医学院生理学研究所）2004 年 6 月 16 日2缺血预适应抗脑缺血再灌注后神经元凋亡的机制( 文献综述 )缺血性脑中风是目前严重威胁人类健康的疾病之一，其发病率及致死率均非常高。尽管近十几年来对脑缺血机制进行了大量研究，但因其机制极为复杂，缺乏有效的干预手段，故预后极差。动物实验研究发现，脑缺血后及时地恢复血流灌注可以逆转缺血半影区的神经元死亡，但在某些易损区却可以诱发迟发性神经元凋亡。脑缺血再灌注后神经元凋亡，是一个复杂的过程，
2、阻止凋亡的发展，将为脑血管病的治疗提供更为准确的理论支持。近年来研究证明，短暂的非致死性缺血及随后的氧化应激启动细胞内信号转导通路，可通过调节靶蛋白活性，特别是促进转录因子如 HIF-1、AP-1、NF-B、P53 等的表达或提高其转录活性，从而合成多种对细胞有保护作用的应激蛋白质，保护细胞免受损伤或修复已有损伤，即所谓缺血预适应（ischemic preconditioning，IP C） 。本文对缺血预适应抗凋亡的机制作以综述，以期对探讨脑缺血再灌注后神经元凋亡的干预措施有所帮助。. 脑缺血再灌注导致神经元凋亡1.1 脑缺血再灌注损伤缺血再灌注损伤是指组织器官缺血一定时间重新得到血液灌注时
3、，其功能不仅未能恢复，结构损伤和功能障碍反而加重的现象。动物实验证明，这种迟发的神经元死亡包括坏死和凋亡两种形式。近 10 余年来，人们对脑缺血再灌注损伤进行了广泛、深入研究，提出“缺血损伤瀑布 ”的概念，但其机制仍未能完全阐明。目前的研究认为，缺血后神经元的凋亡发生是一个多环节调控过程，其中包括基因表达的改变、兴奋性氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、蛋白合成受抑、热休克蛋白表达受阻、脂肪酸与自由基形成、蛋白酶激活等过程，但凋亡机制仍无定论。细胞凋亡是 Kerr 等人在 1972 年提出的，它是一种由基因控制的细胞自主性死亡过程，在生理情况下也称“程序性细胞死亡” ，是维持内环境稳定的机制之一 1
4、。近年来发现细胞凋亡与某些病理状况有关，过度抑制或过度增强均可导致疾病的产生。越来越多的证据表明，神经元凋亡是脑缺血再灌注后迟发性神经元死亡的基本形式，但在耐受细胞中同时发现一种平行的主动神经元存活过程，这两种相反的级联过程均由基因调控 2。有关的基因介绍如下。1.2 凋亡相关基因1.2.1 bcl-2 家族 Bcl-2 是相对分子量为 25KD 的整和膜蛋白，分布于线粒体、内质网和细胞核膜上。其羧基端含疏水序列，与其分布于线粒体膜有关，而其氨基端主要分布于细胞质内。最近研究显示 bcl-2 家族在脑缺血动物模型梗死灶边缘表达增高，不同成员在凋亡过程中对线粒体作用不同，其中 bcl-2、bcl
5、-xl、bcl-w、mcl-1 等对线粒体有保护作用，而bax、bad、bak、bik、bid、bim、bok 及 bcl-x 等则有促凋亡作用，细胞凋亡与否，取决于这两种蛋白的比值 4，5，6 。该族蛋白的功能通常以二聚体的形式所决定，当以 Bcl-2 同源二聚体存在时，发挥抑制细胞凋亡的功能，而当 Bcl-2与 Bax 或 Bid 等形成异源二聚体时，抑制凋亡作用丧失，从而促进凋亡的发生。31.2.2 p53 野生型 p53 基因具有诱导细胞凋亡的功能 7，但该基因突变后可抑制凋亡。野生型 p53 基因编码的 P53 蛋白是一种 DNA 结合蛋白，在细胞周期的G1 期发挥检查点的功能，负责
6、检查染色体 DNA 是否损伤。如有发现有缺陷的DNA，就可刺激 CIP(细胞周期蛋白依赖激酶 CDK-interacting protein-1)的表达，阻止细胞进入细胞周期，并启动 DNA 修复机制。一旦修复失败，P53 则启动细胞凋亡机制。研究发现 P53 介导凋亡的机制不需要 P21 的参与，主要是通过上调 bcl-2 家族的促凋亡成员 bax 及下调抗凋亡成员 bcl-2 和 bcl-xL。Bax 促进cytC 的释放，通过与 Caspase-9 结合而激活死亡执行者 Caspase-3，导致细胞凋亡。1.2.3 Caspase Caspase 家族蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，能在 Asp
7、 之后切割蛋白，迄今已发现十余种 Caspase。脑缺血后，氧化应激、持续性去极化均损伤线粒体通透转换孔（MPT ） ，使线粒体通透性破坏，导致 Cyt C 及凋亡诱导因子 AIF 释放，从而启动调往信号途径。Cyt C 从线粒体释放到细胞浆后与凋亡蛋白酶激活因子 Apaf- 1 结合，激活 Caspase-9，Caspase-9 切割后激活 Caspase-3，后者被认为是凋亡的最终执行蛋白。AIF 从线粒体释放到细胞浆后进入核内，失去其线立体定位序列结构域，表达凋亡效应。实验表明，Bax 可从细胞浆转移到线粒体，增加线粒体膜的通透性，释放 Cyt C 入细胞浆，激活 Caspase-313
8、。1.2.4 fas/apo-1 Fas 是一种细胞表面受体，它伸向细胞浆的部分有一段与TNF 受体相似，与 TNF 和神经生长因子（NGF）受体高度同源。FasL蛋白与 Fas 分子结合，通过信号转导，最终诱发凋亡 8。1.2.5 ICE 基因家族这是最近克隆出的一个哺乳动物的凋亡基因家族，与线虫的 ced-3 有一定同源性，编码丝氨酸蛋白水解酶，可使 IL-1 前体激活。该基因导入小鼠神经元可引起凋亡，且这一作用可被 bcl-2 阻断。1.2.6 其他 crmA、H-ras、TGF-1、RP-2、HSP 等都与神经元凋亡有关。缺血后神经元凋亡与死亡决定簇相关受体（Fas 和 TNF-R）的
9、表达和活化以及 P53 介导的促凋亡性 Bcl-2 家族蛋白 Bax 的上调密切相关。神经元 Fas 或TNF-R 的表达与 Fas 配体和 TNF 分泌增加共同激活死亡受体信号，通过凋亡蛋白酶 Caspase-8 的活化、线粒体膜通透性转运孔（MPT）以及效应性凋亡蛋白酶的活化促进凋亡 3。DNA 损伤可激活两种调节 p53 的激酶，共济失调毛细管扩张空变激酶（ATM）和 DNA 依赖性蛋白激酶（DNAPK ） 。ATM 磷酸化 p53，DNA-PK 磷酸化 p53 抑制蛋白 mdm-2，p53 活化后转移至胞核，起转录因子作用，诱导凋亡效应基因如 Bax 表达。缺血后神经元内已发现 Bax
10、 信使和蛋白表达增加，超过抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 Bcl-x1， 形成 Bax 同源二聚体，并与线粒体外膜结合形成 MPT。这导致 CytC 释放和凋亡执行瀑布的活化。1.3 凋亡的其他机制1.3.1 钙超载 正常生理状态时，细胞外钙离子浓度为细胞内的 10000 倍，细胞通过钙泵或 Na+/Ca2+交换系统，将钙离子排出细胞。脑缺血再灌注时，钙泵功能减弱，同时线粒体、内质网贮留钙作用降低，钙释放增多，引起细胞内钙超载。细胞钙稳态失衡在缺血性神经元凋亡的发生中起关键作用，是导致神经元凋亡的“最后共同通路” 9。钙超载通过激活某些钙离子依赖性蛋白酶 10，引起一系列生物化学和代谢变化的连锁反
11、应，形成凋亡小体。钙超载引起神经元凋亡主要途径是：引起线粒体内钙超载，影响其氧化磷酸化的功能，导致ATP 产生减少；激活一些破坏性的 Ca2+依赖性的蛋白酶，如溶酶体中的中性4蛋白酶、胞膜的磷脂酶 A 和核酸内切酶等，引起细胞结构的破坏； 诱发脑血管痉挛，通透性增加，引起进一步缺血和脑水肿形成；突触前、后膜蛋白质磷酸化，导致进一步 Ca2+超载 10。1.3.2 兴奋性氨基酸和氧自由基兴奋性氨基酸系指中枢神经系统中兴奋性突触的主要神经递质，主要包括谷氨酸和天门冬氨酸。当缺血再灌注时，突触前谷氨酸等释放增多和/或再摄取减少，导致突触后兴奋性氨基酸受体的过度刺激 11。当谷氨酸与其受体 -氨基羟甲
12、基恶丙酸、N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）结合后，促使钠和氯离子以及水的内流，导致神经元急性肿胀。同时 NMDA 调控的钙通道开放，细胞外钙离子大量内流，细胞内钙超载，激活多种蛋白酶。蛋白水解酶可以降解细胞骨架，磷脂酶可以产生氧自由基 12，激活一氧化氮合酶生成一氧化氮，造成细胞膜和线粒体损伤，最终导致细胞膜破坏及神经元损伤，诱导细胞凋亡。再灌流后，由于供氧得到改善，提供了生成自由基的原料，而血液中清除自由基的物质尚未生成，致使自由基呈爆发性增加。自由基与细胞膜上的酶、受体及其它成分结合，影响细胞膜的结构、功能和抗原特异性，加以不饱和脂肪酸的过氧化产物丙二醛可使细胞膜的空隙扩大，通透性增加，
13、导致细胞进一步损伤，加重脑水肿、颅高压。2. 缺血预适应对缺血神经元损伤的保护作用2.1 缺血预适应的概念 缺血预适应是指某一组织一次或多次短暂非致死性缺血再灌注后，该组织对以后较长时间的致死性缺血损伤产生显著的耐受性，表现为实质组织细胞死亡明显减少，梗死范围大幅度缩小，器官功能障碍明显减轻等 14。2.2 动物模型的建立常采用沙鼠或大鼠，以 10%水合氯醛（0.35ml/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。作颈前皮肤正中切口，暴露双侧颈总动脉，首先阻断其全脑血流 1-3 分钟，造成全脑缺血，然后恢复脑血流灌注，数日后再次阻断脑血流8 分钟或更长时间，造成致死性缺血，观察缺血预适应对后继
14、长时间缺血损伤的影响。2.3 常用实验指标2.3.1 生理学方法 记录血压、心电的变化，观察缺血预适应动物模型的血压、心率等指标及其改变，与单纯脑缺血动物进行区别。2.3.2 病理学检查 实验动物断头处死检查后，取其脑在脑前极与视交叉连线中点、视交叉、漏斗柄、漏斗柄与脑叶尾极之间分别作冠状切面。5 片脑组织置于 2%的氯化三苯基四氮唑（TTC，PBS 溶解）溶液，37 0C 恒温避光温育30min。正常脑组织为红色，梗死处为白色。用图象分析仪可测定梗死面积占总脑片面积的百分比。光镜下主要观察神经元变性、坏死和胶质细胞反应。2.3.3 形态学观察：电镜下观察神经元形态学改变。凋亡初期，可见到微绒
15、毛消失，神经元表面光滑，染色体浓集，细胞质浓缩，细胞体积缩小内质网膨胀；中期可见到浓缩的细胞核片段化，细胞表面成泡状，凋亡小体形成；后期凋亡小体被临近的活细胞吞噬。 2.3.4. DNA 降解分析：新鲜脑标本细胞裂解，先用酸或氯仿抽提 DNA，再用乙醇沉淀。在明胶板上电泳后，用溴化乙锭（EB）染色，可出现经典的 DNA 梯形电泳条带（DNA Ladder） 。52.3.5 流式细胞仪检测：利用碘化丙锭（PI）与钙依赖性磷脂结合蛋白（Annexin V ）进行染色，一般活细胞对 PI 拒染，染上时即提示凋亡已进入到较后期，Annexin V 极易与磷脂酰丝氨酸（PS）结合，而 PS 在凋亡早期即
16、从细胞膜内转移到细胞膜外，故可用 Annexin V 来充当探针。2.3.6 3-OH 原位末端标记法（TUNEL 法）：用末端转移酶（TDT ）将标记的脱氧核苷酸（dUTP）转移到 DNA 的断裂末端 3-OH 上，标记物可为地高辛、生物素（间接法）或各种荧光素（直接法）等。然后，在显微镜下或用流式细胞仪记数阳性染色的细胞百分数用于检测细胞凋亡情况。2.3.7 其他指标，如凋亡相关细胞因子或蛋白的检测、免疫组织化学及蛋白免疫印迹分析等2.4 脑缺血预适应保护缺血神经元的机制缺血及随后的氧化应激启动细胞内信号转导通路，通过调节靶蛋白活性，特别是促进转录因子如 HIF-1、AP-1、NF-B、P53 等的表达或提高其转录活性 15 16，从而合成多种对细胞有保护作用的应激蛋白质，保护细胞免受损伤或修复已有损伤。体外研究表明缺血预适应动物模型脑内有新的 mRNA 及蛋白质合成。亚致死性缺血（大鼠颈动脉夹闭 2min）可使脑对其后的缺血（从缺血后
