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1、脂质体吉西他滨对人前列腺原发肿瘤细胞 LNCAP 异种移植瘤模型的抗转移作用原位转移是肿瘤的最大特征，也是威胁患者生命的首要因素。前列腺癌的致命性主要是由于转移扩散，而不是来自原发肿瘤的负荷。在这里，我们通过体内成像和体外组织匀浆的荧光素酶检测，监测了 SCID 小鼠前列腺癌细胞 LNCap 异体移植模型表达的原位荧光素酶/GTP 的生长、转移扩散。尽管转移扩散一般与原发肿瘤体积有显著的相关性，但是感染动物的不同组织对转移灶的敏感性、以及各动物个体也是不同的。在这种移植瘤模型中，我们发现，与传统的 360mg/kg GemLip 相比，在低浓度 8mg/kg 脂质体 GemLip 对原发肿瘤的
2、生长抑制与对淋巴结、肺、肾和胃等部位转移瘤的抑制都有效，前言前列腺癌是欧美国家最常见的恶性肿瘤。仅在德国，每年有近 49000 的新病例（占男性恶性肿瘤的 22.3%）和 11000 死亡（所有的死亡占 10.4%）。前列腺癌的转移扩散及其并发症是导致死亡的首要原因，而不是原发肿瘤。晚期前列腺癌很容易发生转移，倾向于扩散到淋巴结或者骨骼，以及多器官（肺、肝、肾、脾）转移的特点。一旦前列腺肿瘤细胞骨转移之后，治愈已不可能，姑息疗法是唯一的选择。我们研究的目的是要建立一个前列腺原位移植瘤的高转移模型，使用荧光素酶/ 绿色荧光蛋白转导植入原位前列腺癌细胞 LNCap，以研究脂质体 Gemlip是否是
3、前列腺癌的一种新的抗肿瘤转移治疗方案研究方法1.细胞培养和建立细胞株LNCaP.FCG，Du145，PC-3 在 DMEM，前列腺细胞倍增时间相似。2.检测 GemLip 和 gemcitabine 对 LNCaP，Du145，PC-3 细胞的半致死剂量每孔 1 千个细胞铺入 96 孔板，24 小时后加药，48 小时后检测。3.产生表达荧光素酶的前列腺细胞绿 色 荧 光 蛋 的 发 光 机 理 比 荧 光 素 /荧 光 素 酶 要 简 单 得 多 。 一 种 荧 光 素 酶 只 能与 相 对 应 的 一 种 荧 光 素 合 作 来 发 光 ， 而 绿 色 荧 光 蛋 白 并 不 需 要 与 其
4、 他 物 质 合作 ， 只 需 要 用 蓝 光 照 射 ， 就 能 自 己 发 光 。 4.动物实验5.8-12 周龄雄性 SCID 每只小鼠接种 106/25uLDMEM 到前列腺左侧或右侧。通过体内生物荧光检测原位肿瘤。注射 2106/50ul/matrigel 到 SCID 小鼠的左侧诱导前列腺癌皮下移植瘤。每周量三次肿瘤大小，并与荧光素酶(绿色荧光蛋白)的成像相比。肿瘤大小为长宽长/2.在 23 天后对原位移植瘤动物随机分为三组（每组 10 只），去掉最小和最大的原位肿瘤，在未接种肿瘤的 SCID 鼠最大的耐受剂量的预实验中，GemLip 和 Gemc 分别为 8mg/kg 与 360
5、mg/kg。对处理组进行 8mg/kg GemLip 与360mg/kg Gemc 的静脉注射。此外一组为溶剂组。给药三次，每周一次。6.肿瘤血管通透性分析对小鼠静脉注射 100mg/kg 伊文思蓝。30 分钟后，处死小鼠，取血液，肿瘤及骨骼肌样品，称重，在硫酸钠/丙酮混合液中匀浆。避光室温孵化 17 小时后，样品离心。取上清测 620nm 处的吸光值。以血样中的血药浓度为标准，测定伊文思蓝在肿瘤组织及骨骼肌中的含量。7.测量体内生物发光50uL 的 D-荧光素分别腹腔注射到两个部位，然后麻醉动物，10 分钟后，将它们转入摄像系统。用相应软件定量分析图像中生物荧光的光信号。以光子/秒表示。8.
6、体外定量的检测转移灶的荧光素酶将 SCID 小鼠的各组织匀浆，离心检测。研究结果1.体外 LNCAP 细胞对 GemLip 的敏感性通过对 LNCAP 细胞加入不同浓度的药物制剂 12-120h ，并与 Du145，PC-3 前列腺细胞相比较研究药物的作用。在 48 小时的时候用 BrdU 法分析对数生长期的优化和增殖的抑制。如图 1，我们的研究表明，荧光素酶转导的前列腺细胞对传统的 Gemc 是高度敏感的。图 1 左图的表明，在体外，在各种前列腺细胞之间，以及 GemLip 与 Gemc 的 IC50 都没有明显的区别。且荧光素酶转导的前列腺细胞对 Gemc 与 GemLip 与源细胞相比并
7、没有呈现任何敏感性的不同。2.体内前列腺移植瘤的特性：肿瘤生长和血管渗漏为了比较体内转染 LNCAP 细胞的性质，我们分别比较了肿瘤的生长，血管渗漏，皮下异位移植及原位移植的转移性特征。肿瘤生长通过生物荧光检测体内原位移植瘤以及用卡尺测量皮下移植瘤。LNCAP 皮下移植瘤第一次明显观察到是在第 10-12 天，近 95%小鼠长出肿瘤。在 19-21 天的时候，肿瘤达到 100cm3，需要开始药物治疗。肿瘤在 32-35天，长到 1000cm3。使得给药周期为 14 天。原位移植瘤的最初检测到生物荧光在接种后 3-5 天，下一次是 10-13 天。成瘤率为 65%。以后通过生物荧光每周检测一次肿
8、瘤的生长。终止实验的期限要根据动物的健康状况和体重的减少（大于 20%）。在本文中， 肿瘤的生长期限为 54-57 天。使得给药周期为 31-34 天。最终成像的荧光素酶的值与小鼠肿瘤的大小及体重是相关的。体内 PCa 移植瘤的血管通透性，及血管体积的检测，通过伊文思蓝外渗。如图 2b 所示，在 SCID 小鼠异位皮下抑制瘤中，伊文思蓝的外渗，肿瘤与肌肉比率为 3.31。而原位移植瘤明显增大，为 8.13。皮下与原位 LNCAP 移植瘤的转移在 32-35 天中，没有在任何皮下移植瘤的小鼠组织中发现转移灶。即使用敏感的荧光素酶分析组织匀浆。相反，在未处理的原位移植瘤 SCID 小鼠中发现了转移
9、灶。在一些动物的尸解的宏观分析中在脾、肺与腹腔发现了转移灶。然而，在体外灵敏的荧光素分析转导细胞中，各小鼠的所有检测组织中都检测到转移灶。在淋巴结、脾、十二指肠、肺中较明显，而肱骨、腰椎骨、肾、心脏组织样品中较微弱。但各个体以及各个体组织中是不同的。转移灶的分布与最终肿瘤的大小、体重、个体相关。体内脂质体的吉西他滨与吉他西滨对 LNCAP 原位移植瘤的作用实验动物随机分为三个组，分组五天后给药，大约在接种 28 天后，给药三次。在脂质体吉他西滨给药期间，通过荧光素酶在体内的生物荧光每周检测一次肿瘤的生长情况。与对照组相比，对原位移植瘤的药物处理，脂质体吉他西滨处理组明显的降低了荧光信号，肿瘤抑
10、制率为 83.9%，而吉他西滨组也有类似的效果，移植瘤为 70.9。脂质体吉他西滨对原代 LNCAP 原位异体移植瘤的转移灶的作用我们检测了药物处理对抗转移影响。图 6 中分散的点表示实验组各个小鼠的信号。 与对照组相比，脂质体吉他西滨处理组明显的降低了肿瘤向淋巴结、肺、肾及胃转移。而 360mg/kg 吉他西滨只明显的降低了肿瘤向肺与胃的转移。问题一：剂量的不同，觉得同样的剂量，从抑制率，有效率方面比较更好。问题三：接种细胞量不同。问题四：在抑制原位移植瘤转移灶问题上，是因为药物抑制了转移，还是药物对转移后肿瘤的抑制。（癌 症 的 姑 息 疗 法 是 该 疗 法 的 目 的 仅 是 减 轻
11、患 者 的 痛 苦 ， 延 长 患 者 的 生 命 ,使肿 瘤 瘤 块 或 有 缩 小 ， 但 不 能 根 除 。 姑 息 疗 法 多 半 是 在 病 期 晚 ， 患 者 一 般 情 况 差 ，不 能 应 用 根 治 疗 法 时 才 采 用 的 。 姑 息 疗 法 可 有 近 期 的 暂 时 的 效 果 ， 但 患 者 以 后 多半 还 因 肿 瘤 复 发 、 转 移 而 死 于 肿 瘤 。）最 大 耐 受 剂 量 （ MTD） ： 指 在 外 来 化 合 物 急 性 毒 性 实 验 中 ， 化 学 物 质 不 引 起受 试 对 象 （ 实 验 动 物 ） 出 现 死 亡 的 最 高 剂 量 ， 故 可 缩 写 为 LD0。 若 高 于 该剂 量 即 可 出 现 死 亡 。最 大 耐 受 剂 量 是 由 90 天 毒 性 实 验 确 定 的 ， 此 剂 量 应 使 动 物 体 重 减 轻 不 超 过对 照 动 物 的 10%， 并 且 不 引 起 死 亡 及 不 导 致 缩 短 寿 命 的 中 毒 症 状 或 病 理 损 害 。
