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1、7500 Real Time PCR 安装培训 China Service Department 内容简介内容简介内容简介内容简介 一 基本原理 二 化学原理 三 技术应用 四 实时定量PCR概述 五 仪器软件 现场演示 一 基本原理一 基本原理一 基本原理一 基本原理 什么是什么是什么是什么是RealReal time PCR time PCR 实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术 Technology to monitor in real time the PCR amplification of specific nucleic acid targets RealReal time
2、PCRtime PCR是如何实现的是如何实现的是如何实现的是如何实现的 和传统PCR一样具有以下基本要素dsDNADNA 模版 primers引物 dNTPs核苷酸 PCR buffer 缓冲液 Taq polymeraseDNA聚合酶等 TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT Mg2 Mg2 Mg2 Mg2 Mg2 Mg2 T A C G G A G C T G A RealReal time PCRtime PCR是
3、如何实现的是如何实现的是如何实现的是如何实现的 在控温模块 Temperature Block 上实现循环 反应 Denaturating of template 模板变性 Annealing of oligos 引物退火 Extension of primers to make new products 序列扩增 N个个cycles RealReal time PCRtime PCR是如何实现的是如何实现的是如何实现的是如何实现的 在PCR混合液中含有荧光物质 荧光物质 fluorescencefluorescence RealReal time PCRtime PCR是如何实现的是如何实现
4、的是如何实现的是如何实现的 Real Time PCR仪包括thermal block控制温度 halogen lamp 激发荧光 filters 和 CCD camera检 测信号 Thermal cycling block CCD camera Halogen lamp Excitation emission filters PCRPCR Lots of PCR PCR product RealReal time PCRtime PCR是如何实现的是如何实现的是如何实现的是如何实现的 随着扩增的进行 荧光信号会随着PCR产物的增 加而增加 RealReal time PCRtime PCR
5、是如何实现的是如何实现的是如何实现的是如何实现的 Real time PCR仪会纪录每个循环经过每个滤光 片的荧光信号变化 Cycle 1 Filter A Sample 1 Level RealReal time PCRtime PCR是如何实现的是如何实现的是如何实现的是如何实现的 最后 real time软件会对采集到的数据进行分析 二 化学原理二 化学原理二 化学原理二 化学原理 支持的化学试剂支持的化学试剂支持的化学试剂支持的化学试剂 SYBRSYBR Green IGreen ITaqManTaqMan TaqManTaqMan 化学原理化学原理化学原理化学原理 又称又称又称又称
6、5 5 Nuclease Nuclease TaqManTaqMan 中会使用到两段短片段序列中会使用到两段短片段序列中会使用到两段短片段序列中会使用到两段短片段序列 称为双向特异引物 称为双向特异引物 称为双向特异引物 称为双向特异引物 第三段短片段序列 又称为探针第三段短片段序列 又称为探针第三段短片段序列 又称为探针第三段短片段序列 又称为探针 位于位于位于位于 序列中间序列中间序列中间序列中间 报告染料报告染料 Reporter dye 淬灭染料淬灭染料 Quencher dye 探针标记两种探针标记两种探针标记两种探针标记两种 染料分子染料分子染料分子染料分子 Reporter没有
7、荧光信号 发射 能量 光 激发 完整的探针完整的探针完整的探针完整的探针 光能 然而 如果探针断裂了然而 如果探针断裂了然而 如果探针断裂了然而 如果探针断裂了 TaqManTaqMan 进行中进行中进行中进行中 DenaturationDenaturation变性变性变性变性 95 95 C C AnnealingAnnealing退火退火退火退火 60 60 C C TaqTaq酶登场酶登场酶登场酶登场 找到引物序列找到引物序列找到引物序列找到引物序列 开始延伸开始延伸开始延伸开始延伸 60 60 C C ExtensionExtension延伸延伸延伸延伸 60 60 C C Exten
8、sionExtension延伸延伸延伸延伸 60 60 C C ExtensionExtension延伸延伸延伸延伸 60 60 C C Taq酶很特别酶很特别 具有核酸外切酶活性 可以 吃掉 结合到模板上 的DNA片段 TaqTaq酶降解探针酶降解探针酶降解探针酶降解探针 TaqTaq酶降解探针酶降解探针酶降解探针酶降解探针 TaqTaq酶降解探针酶降解探针酶降解探针酶降解探针 嗝 每个循环之后每个循环之后每个循环之后每个循环之后 理论上 反应管里的目标片断数会加倍 报告荧光信号相应成比例增长 RealReal Time Time 扩增检测扩增检测扩增检测扩增检测 Fluorescence
9、荧光信号 循环数 ABI 7500 TaqManABI 7500 TaqMan 荧光染料选择荧光染料选择荧光染料选择荧光染料选择 报告荧光分子 FAM VIC JOE NED CY3 CY5 Texas Red 淬灭荧光分子 TAMRA MGB non fluorescent SYBRSYBR Green I Green I 化学原理化学原理化学原理化学原理 SYBRSYBR Green I Green I 染料染料染料染料 SYBRSYBR Green I Green I 染料染料染料染料 SYBRSYBR Green I Green I 染料染料染料染料 SYBRSYBR Green I
10、Green I 染料的缺点染料的缺点染料的缺点染料的缺点 非特异结合非特异结合任意任意双链双链DNA 定量结果不准确定量结果不准确 非特异性非特异性PCR产物信号产物信号 使用使用使用使用 Melt curve Melt curve 检查反应特异性检查反应特异性检查反应特异性检查反应特异性 Temperature Fluorescence Melt curve Melt curve 导数图谱导数图谱导数图谱导数图谱 一个干净的峰 没有无关的产物 Temperature Fluorescence Melt curveMelt curve的杂峰的杂峰的杂峰的杂峰 可能是引物二聚体 到底用哪一种化学
11、方法呢 到底用哪一种化学方法呢 到底用哪一种化学方法呢 到底用哪一种化学方法呢 TaqMan 还是 SYBR Green TaqManTaqMan 还是还是还是还是 SYBRSYBR Green I Green I 优点 更高的特异性 不会有引物二聚体干扰 支持多重荧光实验设计 实验方法易于优化 缺点 价格稍贵 优点 价格便宜 大部分基因以及少量样 品均适用 缺点 特异性稍差 必须要做 Melt curves 不支持多重荧光设计 实验方法通常需要优化 三 技术应用三 技术应用三 技术应用三 技术应用 AB AB 支持支持支持支持3 3种技术应用种技术应用种技术应用种技术应用 Presence
12、Absence Allelic Discrimination End point 终点检测终点检测 Quantitative PCRReal time 实时检测实时检测 终点检测终点检测终点检测终点检测 vs vs 实时检测实时检测实时检测实时检测 End point 方法 不需要实时数据收集 只需要2分钟样品扫 描 不是定量实验 是定性实验 可以在普通PCR仪上完成扩增 终点检测终点检测终点检测终点检测 vs vs 实时检测实时检测实时检测实时检测 Real time 方法 使用实时定量PCR仪 在每个循环后采集 数据 任何定量实验所必须的 四 实时定量四 实时定量四 实时定量四 实时定量P
13、CRPCR概述概述概述概述 PCR PCR 有三个显著阶段有三个显著阶段有三个显著阶段有三个显著阶段 几何级数扩增期 常称 对数对数对数对数 或或或或 指数指数指数指数 扩增期扩增期扩增期扩增期 线形扩增期 平台期 PCR PCR 产物产物产物产物 log log 图谱图谱图谱图谱 PCR PCR 循环数循环数循环数循环数 指数指数指数指数 对数扩增对数扩增对数扩增对数扩增 PCRPCR的三个阶段的三个阶段的三个阶段的三个阶段 指数指数指数指数 对数扩增对数扩增对数扩增对数扩增 线性扩增线性扩增线性扩增线性扩增 PCR PCR 产物产物产物产物 log log 图谱图谱图谱图谱 PCR PCR
14、 循环数循环数循环数循环数 PCRPCR的三个阶段的三个阶段的三个阶段的三个阶段 指数指数指数指数 对数扩增对数扩增对数扩增对数扩增 线性扩增线性扩增线性扩增线性扩增 PCR PCR 产物产物产物产物 log log 图谱图谱图谱图谱 PCR PCR 循环数循环数循环数循环数 平台期平台期平台期平台期 停停 PCRPCR的三个阶段的三个阶段的三个阶段的三个阶段 定量实验定量实验定量实验定量实验 只有一个扩增期提供高质量 可重复性数据 指数指数指数指数 对数扩增期对数扩增期对数扩增期对数扩增期 1 1 重复性重复性重复性重复性 实验结果可重复实验结果可重复实验结果可重复实验结果可重复 相同样品的
15、扩增曲线集中相同样品的扩增曲线集中相同样品的扩增曲线集中相同样品的扩增曲线集中 40 identical replicates 2 2 准确性准确性准确性准确性 接近真实值接近真实值接近真实值接近真实值 最好完全射中靶心最好完全射中靶心最好完全射中靶心最好完全射中靶心 3 3 动态范围动态范围动态范围动态范围 兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围 越大越好越大越好越大越好越大越好 指数指数指数指数 对数扩增期对数扩增期对数扩增期对数扩增期 重复性重复性重复性重复性 准确性准确性准确性准确
16、性 动态范围动态范围动态范围动态范围 3个阶段中 最佳时期 个阶段中 最佳时期 指数指数指数指数 对数扩增期对数扩增期对数扩增期对数扩增期 好 好 好 好 10 fold dilutions of a single sample Log fluorescent scale 指数 对数 线形扩增期线形扩增期线形扩增期线形扩增期 不太好 不太好 不太好 不太好 10 fold dilutions of a single sample Log fluorescent scale 指数对数 线性 平台期平台期平台期平台期 差 差 差 差 10 fold dilutions of a single sample Log fluorescent scale 指数 对数 平台 线性 RealReal Time PCR Time PCR 专用术语专用术语专用术语专用术语 Baseline Baseline 基线基线基线基线 定义背景区域 cycle to cycle 范围 在哪里设置在哪里设置在哪里设置在哪里设置 baselines baselines 通常起点为 cycle 3 在哪里设置在哪里设置
