《荧光定量PCR实验设计及结果分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光定量PCR实验设计及结果分析（23页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实时荧光定量PCR 实验的设计及结果的分析 基因有限公司 王争强 对照组对照组对照组对照组 用作对照的样本 与实验组进行比较 实验组实验组实验组实验组 未知样本 用于研究 目的基因目的基因目的基因目的基因 GOI 用于研究的基因 内参基因内参基因内参基因内参基因 看家基因看家基因看家基因看家基因 基因表达量比较恒定的基因 用于校正起始上样量的区别 参比样本参比样本参比样本参比样本 Calibrator 用于比较的样本 如未处理样本 正常组织 0时相样本等 标准品标准品标准品标准品 Standards 梯度稀释的已知浓度的样品 测定未知样品的浓度和反应效率 Ct值值值值 样品扩增产物的荧光信号达
2、到所设定的荧光阈值时需要的循环数 反应效率反应效率反应效率反应效率 E PCR扩增的速率 术语术语术语术语 RT qPCR流程示意图 样本的准备样本的准备样本的准备样本的准备 速度 RNA 降解 RNA酶抑制剂 保存条件 分离试剂的选择分离试剂的选择分离试剂的选择分离试剂的选择 液态或组织 植物 动物或者微生物 RNA 质控质控质控质控 RNA的完整性 RNA的纯度 RNA的浓度 抑制因子的影响 RNA 提取提取提取提取 逆转录引物逆转录引物逆转录引物逆转录引物 随机六核苷酸引物 总RNA 或者 OligodT 引物 mRNA 扩增产物在5 端时 尽量避免用OligodT做引物 逆转录酶逆转录
3、酶逆转录酶逆转录酶 较高的逆转温度可以减少cDNA二级结构的形成 Freeman et al 1996 逆转录效率逆转录效率逆转录效率逆转录效率 理论上RNA mRNA逆转录成cDNA的效率是100 70 单链结合染料Oligreen 可以用于测定cDNA的浓度 逆转录逆转录逆转录逆转录 实时扩增实时扩增实时扩增实时扩增 插入式染料插入式染料插入式染料插入式染料 成本低 适用于所有的双链 研究基因较多时适用 特异性低 双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针 TaqMan探针探针探针探针 特异性高 目的基因浓度低时结果可靠 需要设计探针及反应条件优化 目的基因较少时适用 成本较
4、高 荧光物质的选择荧光物质的选择荧光物质的选择荧光物质的选择 实时检测实时检测实时检测实时检测 SYBR Green I 5 3 5 3 SG Excitation SG SG SG SG Emission 5 3 5 3 SG SG SG SG SG Excitation 实时检测实时检测实时检测实时检测 SYBR Green I RQ 5 3 5 3 5 3 5 3 激发 R Q Q R Q R 激发 实时检测 双标记探针 免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件 Primer3 http frodo wi mit edu 引物和双标
5、记水解探针的设计 Tm的计算 MFold http bioweb pasteur fr seqanal interfaces mfold simple html 引物和扩怎产物二级结构的预测 二级结构的稳定性 delta G 和融解温度 Tm BLAST 结构特异性 引物和探针的设计引物和探针的设计引物和探针的设计引物和探针的设计 引物与探针的距离 10碱基 避免二级结构 GC含量 45 55 探针Tm高于引物10 oC 左右 70 oC 5 端保证不是G 探针少于30个碱基 3 端最后5个碱基不要超过 2C或2G 3 端添加磷酸基团 BLAST 保证探针特异性 探针设计原则探针设计原则探针设
6、计原则探针设计原则 扩增产物扩增产物扩增产物扩增产物 产物越短 反应效率越高 理想状态为75 150 bp 避免形成稳定的颈环二级结构 避开回文序列 避开G C含量较高的序列 引物引物引物引物 避免二级结构 发卡 避免出现4个连续相同的碱基 尤其是G 尽量避免二聚体 长度18 25 nt Tm值 60oC GC含量 45 55 保证引物特异性 引物不含有内含子序列 引物的设计引物的设计引物的设计引物的设计 SYBR Green I 浓度浓度浓度浓度 不同稀释倍数进行实验 较高浓度抑制PCR反应 较低浓度导致信号较低 引物浓度引物浓度引物浓度引物浓度 上下游引物浓度 300 nM 固定DNA模板
7、浓度进行优化 阳性对照和阴性对照 最优的引物浓度 Ct值较小 信噪比较高 融解曲线分析扩增产物特异性 电泳分析确定扩增产物的长度 MgCl2浓度浓度浓度浓度 Mg2 最优的MgCl2浓度 1 5 3 5 mM 反应优化反应优化反应优化反应优化 掺入式染料掺入式染料掺入式染料掺入式染料 引物和探针浓度引物和探针浓度引物和探针浓度引物和探针浓度 引物浓度25 900 nM 探针浓度10 250 nM 引物 探针 3 1 最优的引物浓度 Ct值较小 信噪比较高 电泳分析确定扩增产物的长度 反应优化反应优化反应优化反应优化 双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针 4 5 M 1 5
8、M 水 229 5 l 10 x 缓冲液 85 l MgCl2 51 l dNTP 68 l Taq 8 5 l DNA 34 l 10 l 6 25 M probe 10 l 3 75 M probe add 10 l 1 25 M probe 取15 l 加入下列PCR反应管中 上游引物上游引物上游引物上游引物 4 5 M1 5 M 0 25 M4 5 M1 5 M 0 25 M4 5 M 1 5 M 0 25 M 取140 l 预混液加入下列反应管中 5 l 5 l 0 25 M 下游引物下游引物下游引物下游引物 定量分析定量分析定量分析定量分析 定量方法的选择定量方法的选择定量方法的选
9、择定量方法的选择 绝对定量绝对定量绝对定量绝对定量 相对定量相对定量相对定量相对定量 双标曲线双标曲线双标曲线双标曲线 CT Assumption Free Analysis LinReg Relative Expression Software Tool REST 基因型分析基因型分析基因型分析基因型分析 综述 Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assays SA Bustin J Mol Endo 2000 25 169 193 标准
10、曲线可通过已知浓度的cDNA RNA来构建 注意事项注意事项注意事项注意事项 DNA RNA纯度 精确移液 标准品的稳定性 避免DNA作为RNA的标准品 绝对定量绝对定量绝对定量绝对定量 Two Standard Curves Concentration normalisation ratio mean G O I mean Ref Relative value Ratio Sample Ratio Calibrator Software steps 无需标准曲线 测定相对表达量 GOI和REF反应效率相同或者相似 需验证 假定反应效率100 CT或或或或 比较比较比较比较CT分析分析分析分析 Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2 delta delta C T Method Livak KJ 25 4 402 408 总结总结总结总结 减少样品与反应间的差异减少样品与反应间的差异减少样品与反应间的差异减少样品与反应间的差异 选择合适的方法并优化选择合适的方法并优化选择合适的方法并优化选择合适的方法并优化 分析数据分析数据分析数据分析数据
