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1、细菌应激反应中的蛋白质组学研究摘要：蛋白质组学(Proteomics)是合并双向电泳分离和质谱分析技术，并应用生物信息学阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式的一个研究领域。它能促进我们对于特殊条件下生理现象的理解。当外部生存环境发生变化时，细菌会在短时间内发生应激反应。利用 2-D 技术结合生物质谱鉴定的方法对细菌蛋白表达谱变化进行研究，是细菌转录谱变化研究的深入和扩展，是细菌应激反应研究中的新热点。关键字：蛋白质组学，应激反应，细菌正文：蛋白质组学(Proteomics)是合并双向电泳分离和质谱分析技术，并应用生物信息学阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式的一个研究领域，包括蛋白质的
2、表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。自从这一概念在1994 年被提出以来，就一直是是医学领域研究的前沿。蛋白质组学研究可以提供关于蛋白质合成中的变化、降解速率、后转录突变、蛋白质相互作用、亚蛋白定位等没有价值的信息，它能促进我们对于特殊条件下生理现象的理解。许多研究被开展来研究细菌在不同生长环境下/基因生长压力下的蛋白表达，在系统生物学水平上揭示了新的潜在的途径和相对丰富的蛋白质。当细菌的外部生存环境发生变化时，细菌会在短时间内产生应激反应，调整其蛋白表达谱，阻遏冗余蛋白或者非必需蛋白的表达，将资源尽可能的用于合成
3、那些对于细菌应对环境所必须的蛋白质。从分子水平上讲，当细菌遭遇到一个特定的压力的时候，对环境的应激反应是一个十分复杂的反应过程，其基因组的大部分基因都会参与这个过程，对细菌应激反应进行研究的目的，就是要找到在这些压力条件下发挥关键性作用的蛋白。研究应激反应最直接最普遍的方法就是蛋白双向电泳结合质谱鉴定的技术，这一技术一方面可以从整体水平上研究细菌应对环境变化时发生的蛋白质谱变化，一方面可以通过研究胶块上的蛋白质点来研究参与了应激反应的单个蛋白质的表达量和蛋白性质的变化。两方面相融合，可以解释应激反应中的蛋白质变化，分析他们的生化性质，阐明应激反应中的分子调节剂机制。目前，学术界对于细菌的应激反
4、应造成蛋白质组变化的研究主要集中在以下几个方面1.温度变化大多数细菌在其自然生活史中都会遭遇到生长温度的变化，因此，细菌必须具备快速感受外界环境温度变化并通过调节代谢抵御温度变化对自身的伤害的能力。在用转录组学和蛋白质组学方法对一株蓝细菌的热休克反应进行系统的研究时，把蓝细菌的培养温度提升为 44，20min 后一些分子伴侣及蛋白酶的编码基因开始被诱导转录，60min 后，一些分子伴侣和蛋白酶的表达水平也有所提高，但是，延伸因子的的表达调控似乎主要是在蛋白水平。在对普通脱硫弧菌热休克反应的研究中，应用双向电泳和基因芯片的方法发现的DnaK、HtpG 、HtrA、AhpC 等热休克蛋白的表达变化
5、说平是一致的。此外，还发现，DnaK 、AhpC 、GroES、GroEL 及几个周质 ABC 转院单摆可能存在翻译后修饰。变异链球菌在温度升高时也有特异性感受温度变化的应激蛋白的表达量上升。在对一株湿热脂肪芽孢杆菌的冷休克反应进行蛋白质组学研究时，将其从最适的生长温度 65培养变为 37和 25培养时，可发现它的葡糖基转移酶、Mrp 蛋白同原体、二氢乳清酸酶、假想的转录因子、 RibT 蛋白、活性硫酸盐还原酶及转录激活子 RsfA 等的表达差异有较大变化。在产生差异表达的 53 种蛋白中，有 6 种冷休克蛋白都与细菌产生芽孢的信号转到过程有关。2.渗透压变化研究表明，在高盐（NaCl）环境与
6、高渗透压（山梨醇）环境下，细菌的反应机制存在一定差异，但是感受渗透压变化的应激反应相关蛋白在两种情况下应该是相同的。研究枯草芽孢杆菌在由 NaCl 产生的高渗透压环境中的应激反应造成的蛋白质组变化时，发现在高渗透压条件下，许多生长相关的酶都被抑制了，但是催化葡萄糖转变为 2-酮戊二酸的酶的表达量没有明显变化，参与硫酸盐同化过程及 Fe-S 结构形成的酶类被诱导表达，此外 SigW 调控元及 PerR调控元成员的表达量也有升高。在变异链球菌的研究中，高渗透压环境诱导了52 个蛋白的合成，其中十个是特异性感受渗透压变化的应激蛋白。在酵母的研究中发现，高渗透压条件下，Hor2p 的表达量会上升，Td
7、h3p 和 Eno2p 的表达量不变，也就是说，在高渗透压条件下，乙醇脱氢酶活性升高，乙醛脱氢酶活性下降，造成了丙三醇和海藻糖的积累。对于病原菌研究来说，外膜蛋白在治病过程中发挥了重要作用。在对副溶血弧菌处于不同 NaCl 浓度下时的膜蛋白进行提取并进行双向凝胶电泳，结果发现，OmpW 、OmpV、延伸因子 TU 及极性鞭毛蛋白都属于感受渗透压变化的外膜蛋白。3.过氧化物或者超氧化物胁迫在对枯草芽孢杆菌对过氧化物及超氧化物刺激下的应激反应进行转录组学和蛋白质组学研究时发现，在氧化压力下，反应蛋白可以分为两类，一类蛋白在两种氧化压力下具有相似的表达模式，如 PerR 和 Fur 调控元中的成员，
8、另一类仅仅对其中一种刺激敏感，如 SOS 调控元中的成员在过氧化物刺激下会表达上调，而参与硫酸盐同化过程及甲硫氨酸生物合成的蛋白仅在超氧化物刺激下诱导表达。在嗜热脂肪芽孢杆菌氧化应激的蛋白质组学研究中，氧化压力能够诱导过氧化物酶的表达发生变化。过氧化物酶有 Prx、Prx 、Prx、Prx 四种异构体，H2O2 能使 Prx的丰度降低，诱导 Prx、Prx、Prx 丰度升高。这种异构体之间的丰度变化，可能是一种翻译后修饰造成的。变异链球菌在氧化压力下，有 69 个蛋白的表达量上升，其中有 15 个是特异性感受氧化压力的蛋白。牙龈卟啉病单胞菌是一种厌氧病原菌，但是它仍然具有一定的氧耐受能力。在对
9、比了该菌在有氧压力条件和厌氧条件下培养的蛋白表达谱后发现，在有氧压力下，很多蛋白的表达收到了影响，特别是 HtpG、GroEL 、DnaK、AhpC 含有 TPR 结构域的蛋白，以及引发因子的表达量都持续升高。以上结果表明，厌氧菌与需氧菌的氧化应激研究策略是不相同的。对于厌氧培养的细菌，有氧培养的条件就可以激发氧化应激反应，对于有氧培养的细菌而言，需要使用过氧化物来创造氧化压力条件。4.其他费氏丙酸杆菌是一种生活在人类消化道中的益生细菌，它时常会受到来自消化道中的物质的胁迫。在费氏丙酸杆菌受到胆汁盐胁迫时，至少有 24 种蛋白被诱导表达，这 24 种胆汁盐应激蛋白包括信号感受与转导蛋白，sig
10、ma 因子以及一些常见的胁迫应激蛋白。蓝细菌 PCC6803 在 pH 值改变的条件下，蛋白表达谱有较大的变化。在 pH 7.5 和 pH 5.5 培养条件下，可溶性胞质蛋白组分中有四个蛋白的表达量发生了显著变化，但几个通用压力蛋白的丰度都没有发生预期变化。周质蛋白质组对pH 值的改变表现出更加明显的变化，除了已知作用的草酸脱羧酶和碳酸酐酶之外，周质中还有几个未知功能的蛋白丰度变化显著。恶臭假单胞菌 DOT-T1E 对于有毒有机物质甲苯有较高的耐受性，它可以通过 TtgABC、TtgDEF、TtgGHI 三个流出泵将甲苯泵出细胞从而减少甲苯对细胞的毒害。在利用双向凝胶电泳对其进行蛋白质组研究时
11、发现，有 134 种蛋白可以对甲苯胁迫进行特异性应答，其中有 35 种蛋白的表达量上调了至少两倍，26 种蛋白的表达量下调了至少两倍。其中表达上调的蛋白主要可以分为四类，第一是与甲苯代谢有关的蛋白，第二是参与 Krebs 循环或者嘌呤代谢的蛋白，三是糖运输相关蛋白，最后是一些胁迫相关蛋白。据此我们推测，该菌对于甲苯的应激反应需要消耗较多的能量。细菌生长过程中遇到的营养物质匮乏及此生代谢产物刺激都可以看做是一种压力条件，细菌对这些环境改变的反应也属于应激反应的范畴。研究发现，在枯草芽孢杆菌的培养过程中，随着葡萄糖的消耗，细菌生长逐渐进入葡萄糖饥饿状态，此时有 150 种蛋白开始从头合成，近 40
12、0 种蛋白合成终止。对变异链球菌的研究发现，对培养基进行稀释会诱导 58 个蛋白的合成，其中 11 个是特异性感受饥饿状态的应激蛋白。研究细菌的应激反应可以帮助我们理解细菌入侵宿主防御系统的机制，能够为疫苗研制、相关阻断药物的开发提供理论基础和研究方向。还可以帮助我们深入理解细菌抵御恶劣化学和物理环境的机制，能够为食品保藏、利用细菌保护环境以及研发特殊用途的工业菌株提供宝贵资料。在蛋白质组学研究领域，尽管 2-DE 技术还存在一定局限性，但是与其他方法相比，2-DE 具有很高的分辨率、最好的重复性。而且具有翻译后修饰的蛋白会在胶图上面分布于不同位置，使得对其修饰的鉴定研究非常容易。目前对细菌的
13、蛋白质组学研究及积累的相关数据远远不够，利用蛋白质组学技术探讨细菌应激反应将会成为细菌学研究的一个新热点。参考文献：1. 陈海荣等, 生物膜形成相关的铜绿假单胞菌蛋白质组学研究. 中华医院感染学杂志, 2010. 20(6): 第 751-754 页.2. 刘琳娜等, 胃癌和慢性胃炎患者幽门螺杆菌蛋白质组学分析. 胃肠病学, 2011. 16(7): 第 409-412 页.3. 潘世忠等, 1122 曲轴有限元分析与结构改进. 内燃机与动力装置, 2008(1): 第 8-13 页.4. 王维平与王成英, 蛋白质组学技术在细菌和真菌研究中的应用. 医学信息（中旬刊）, 2010. 05(10
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