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1、线粒体( Mitochondrion )一. 绪言线粒体的基本概念线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，主要功能是把氧化各种底物产生的自由能转化为可被细胞直接利用的形式ATP，是动物细胞生成 ATP 的主要地点，是细胞有氧呼吸的基地和供能的场所，供应细胞生命活动 95%的能量 。同时还是一种双膜结构内含 DNA 的半自主性细胞器二.线粒体的研究简史1. 1890 年，德国的 Altmann 用光学显微镜观察固体染色法 染色的动物细胞时，发现一种颗粒状的结构，称为生命小体（bioblast）2. 1897 年，本达（ Benda）用改良的固体染色法观察研究动物细胞时，清楚地看到了细胞内有一种
2、颗粒状物质，给它命名为线粒体。线粒体一词是根据希腊语的 mitos（纤维状的）和 chondros（颗粒的）而产生的，意即线粒体像个细线头状的小颗粒。后来许多人的观察都证实了线粒体在细胞里的普遍存在。 3. 1900-1950 年间，人们对线粒体的功能进行了初步研究，确认柠檬酸循环，氧化磷酸化和脂肪酸氧化都发生在线粒体内，线粒体是细胞呼吸作用的主要场所 ，细胞活动所需要的能量大部分都是线粒体中合成的 ATP 提供的。4. 1943 年，Claude 用高速离心技术分离到包括线粒体在内的各种细胞器。5. 1952-1953 年，Palade 和 Sjostrand 在电镜下观察到线粒体的精细结构
3、。6. 1961 年英国生化学家 Mitchell 提出化学渗透假说（chemical coupling hypothesis),并因此获得 1978 年的诺贝尔化学奖。7. 19621963 年，瑞斯(Ris) 和纳斯(Nass)等分别用电子显微镜在藻类的线粒体和叶绿体中及鸡肝细胞的线粒体中观察到了呈小细纤维状的 DNA 分子。为 DNA 在线粒体中的存在，提供了令人信服的证据。8. 1970 年，Margulis 提出线粒体起源的内共生假说。9. 1974 年，Uzzell 等人提出线粒体起源的非共生假说。10. 1981 年，barrell 领导的研究小组完成了人和牛线粒体的全核苷酸的测
4、序工作，同时， Giuseppe Attardi 也分析了人线粒体转录的过程。11. 1987 年，凯恩和威尔逊在自然杂志上发表文章，称他们从不同人种的 148 个胎盘中提取的线粒体 DNA 研究结果表明，人类共同起源于 20 万年前一位非洲女性，称为线粒体夏娃。 “线粒体夏娃”假说得到了认为人类起源于非洲的科学家的支持。12. 1994 年 Walker 等发表了 0.28nm 分辨率的牛心线粒体 F1-ATP 酶的晶体结构，为 Boyer 较早（1979年）提出的结合变化和旋转催化机制提供了结构基础，两人因此（有关 ATP 合成机制的研究）获得1997 年的诺贝尔化学奖。13. 1995
5、年 Wang 等人发现各种凋亡诱导因子诱发细胞凋亡后，细胞质中的细胞色素 C 含量增加，表明线粒体通过释放细胞色素 C 参与细胞凋亡。三.线粒体的主要研究技术1. 显微镜技术与制片、染色技术（光学、电子显微镜，冷冻蚀刻技术）2. 高速离心分离技术3. 细胞化学技术4. Xray diffraction5. Flow cytometry and PCR四. 线粒体的形态结构线粒体的形态、大小、数量与分布线粒体的形态、大小、数量和分布，在不同细胞内变化很大，就是同一细胞在不同的生理状态下也不一样。线粒体在生活细胞中具有多形性、易变性、运动性和适应性等特点。形状:以线状和颗粒状较为常见，也可见哑铃形
6、等其它形状。大小：直径一般为 0.5-1.0 um，长 1.5-3.0 um。数量：从一个至数百个到数千个不等。线粒体数目还与细胞的生理功能状态有关。分布：以有利于细胞需能部位的能量供应的方式进行。线粒体在细胞内的迁移往往与微管有关。线粒体的超微结构外膜(outer membrane ）：含孔蛋白(porin)，允许 5000 以下的分子通过，通透性较高。内膜（inner membrane）：高度不通透性，向内折叠形成嵴（cristae） ，含有与能量转换相关的蛋白，如执行氧化反应的电子传递链、ATP 合成酶、线粒体内膜转运蛋白。膜间隙（intermembrane space）：含许多可溶性酶
7、、底物及辅助因子，利用 ATP 使其他核苷酸磷酸化。基质（matrix）：含三羧酸循环酶系、线粒体基因表达酶系等以及线粒体 DNA, RNA，核糖体。五线粒体的化学组成及酶的定位线粒体组分分离方法： 线粒体的化学组成：蛋白质(线粒体干重的 65 70)脂类(线粒体干重的 2530 ) ：磷脂占 3/4 以上，外膜主要是卵磷脂，内膜主要是心磷脂。线粒体脂类和蛋白质的比值: 内膜 0.3 : 1外膜 1 : 1 线粒体主要酶的分布部 位 酶 的 名 称 部 位 酶 的 名 称外 膜单 胺 氧 化 酶NADH-细 胞 色 素 c还 原 酶 （ 对 鱼 藤 酮 不 敏 感 ）犬 尿 酸 羟 化 酶酰
8、基 辅 酶 A合 成 酶膜 间 隙腺 苷 酸 激 酶二 磷 酸 激 酶核 苷 酸 激 酶内 膜细 胞 色 素 b， c， c1， a， a3氧 化 酶ATP合 成 酶 系琥 珀 酸 脱 氢 酶 -羟 丁 酸 和 -羟 丙 酸 脱 氢 酶肉 毒 碱 酰 基 转 移 酶丙 酮 酸 氧 化 酶NADH脱 氢 酶 （ 对 鱼 藤 酮 敏 感 ）基 质柠 檬 酸 合 成 酶 、 苹 果 酸 脱 氢 酶延 胡 索 酸 酶 、 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶顺 乌 头 酸 酶 、 谷 氨 酸 脱 氢 酶脂 肪 酸 氧 化 酶 系 、天 冬 氨 酸 转 氨 酶 、蛋 白 质 和 核 酸 合 成 酶 系 、丙 酮
9、酸 脱 氢 酶 复 合 物线 粒 体 主 要 酶 的 分 布六. 线粒体主要功能是进行氧化磷酸化，合成 ATP，为细胞生命活动提供直接能量；与细胞中氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞的信号转导、细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控有关。氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)的分子基础氧化磷酸化过程实际上是能量转换过程，即有机分子中储藏的能量 高能电子质子动力势 ATP氧化(电子传递、消耗氧 , 放能)与磷酸化(ADP+Pi ，储能)同时进行，密切偶连，分别由两个不同的结构体系执行电子传递链(electron-transport chain ）的四种复合物，组成两
10、种呼吸链：NADH 呼吸链, FADH2 呼吸链。复合物：NADH-CoQ 还原酶复合物（既是电子传递体又是质子移位体）组成：含 42 个蛋白亚基，至少 6 个 Fe-S 中心和 1 个黄素蛋白。作用：催化 NADH 氧化，从中获得 2 高能电子 辅酶 Q； 泵出 4 H+复合物：琥珀酸脱氢酶复合物（是电子传递体而非质子移位体）组成：含 FAD 辅基，2Fe-S 中心，作用：催化 2 低能电子 FADFe-S 辅酶 Q (无 H+泵出)复合物：细胞色素 bc1 复合物（既是电子传递体又是质子移位体）组成：包括 1cyt c1、1cyt b、1Fe-S 蛋白作用：催化电子从 UQH2cyt c；
11、泵出 4 H+ （2 个来自 UQ，2 个来自基质） 复合物：细胞色素 C 氧化酶（既是电子传递体又是质子移位体）组成： 二聚体，每一单体含 13 个亚基，作用：催化电子从 cyt c 分子 O2 形成水，2 H+泵出， 2 H+ 参与形成水在电子传递过程中，有几点需要说明1. 四种类型电子载体：黄素蛋白、细胞色素(含血红素辅基) 、Fe-S 中心、辅酶 Q。前三种与蛋白质结合，辅酶 Q 为脂溶性醌。2.电子传递起始于 NADH 脱氢酶催化 NADH 氧化，形成高能电子(能量转化)， 终止于 O2 形成水。 3.电子传递方向按氧化还原电势递增的方向传递(NAD+/NAD 最低，H2O/O2 最
12、高)4.高能电子释放的能量驱动线粒体内膜三大复合物(I,III,IV,皆为 H+-泵)将 H+从基质侧泵到膜间隙， 形成跨线粒体内膜 H+梯度(能量转化)5.电子传递链各组分在膜上不对称分布ATP 合成酶（ATP synthase）(磷酸化的分子基础)1.分子结构2.线粒体 ATP 合成系统的解离与重建实验证明电子传递与 ATP 合成是由两个不同的结构体系执行, F1 颗粒具有 ATP 酶活性3.ATP 合成机制Banding Change Mechanism (Boyer 1979)4. 工作特点：可逆性复合酶，即既能利用质子电化学梯度储存的能量合成ATP, 又能水解 ATP 将质子从基质泵
13、到膜间隙5. 亚单位相对于 亚单位旋转的直接实验证据 亚单位有一段 His6 序列，可以结合在覆盖有金属的玻璃上， 亚单位水解 ATP 提供能量时，在荧光显微镜下，可见 亚单位上结合的荧光标记的肌动蛋白纤维逆时针方向 120 度不连续旋转氧化磷酸化的偶联机制化学渗透假说(Chemiosmotic Hypothesis, Mithchell,1961)化学渗透假说内容：电子传递链各组分在线粒体内膜中不对称分布，当高能电子沿其传递时，所释放的能量将 H+从基质泵到膜间隙，形成 H+电化学梯度。在这个梯度驱使下，H+穿过ATP 合成酶回到基质，同时合成 ATP,电化学梯度中蕴藏的能量储存到 ATP
14、高能磷酸键。质子动力势(proton motive force)的来源支持化学渗透假说的实验证据表明：质子动力势乃 ATP 合成的动力膜应具有完整性电子传递与 ATP 合成是两件相关而又不同的事件线粒体能量转换过程略图：七. 线粒体是半自主性细胞器半自主性细胞器的概念： 自身含有遗传表达系统(自主性) ；但编码的遗传信息十分有限，其 RNA 转录、蛋白质翻译、自身构建和功能发挥等必须依赖核基因组编码的遗传信息(自主性有限) 。1、 线粒体 DNAmtDNA 形状、数量、大小 双链环状(除绿藻 mtDNA，草履虫 mtDNA)mtDNA 大小在动物中变化不大，但在植物中变化较大（高等植物：120
15、kbp200kbp）人 mtDNA：16,569bp，37 个基因( 编码 12S,16S rRNA；22 种 tRNA；13 种多肽：NADH 脱氢酶 7 个亚基，cyt b-c1 复合物中 1 个 cytb，细胞色素 C 氧化酶 3 个亚基， ATP 合成酶 2 个 Fo 亚基)mtDNA 以半保留方式进行自我复制mtDNA 复制的时间主要在细胞周期的 S 期及 G2 期， DNA 先复制，随后线粒体分裂2、 线粒体蛋白质合成 线粒体合成蛋白质的种类十分有限酶 复 合 物 总 数 亚 基 数 目胞 质 核 糖 体 合成 线 粒 体 核 糖 体 合成细 胞 色 素 氧 化 酶细 胞 色 素 b-c1复 合 物ATP酶核 糖 体 大 亚 基核 糖 体 小 亚 基 779302 4653021 31401酵 母 线 粒 体 主 要 酶 复 合 物 的 生 物 合 成酵 母 线 粒 体 主 要 酶 复 合 物 的 生 物 合 成线粒体蛋白质合成体系对核基因组具有依赖性不同来源的线粒体基因，其表达产物既有共性，也存在差异。3、 线粒体蛋白质的运送与组装线粒体蛋白质运送的相关复合物定位于线粒体基质的蛋白质的运送 定位于线粒体内膜或膜间隙的蛋白质运送八. 线粒体的增殖与起源 线粒体的增殖： 由原来的线粒体分裂或出芽而来。 线粒体的起源1. 内共生起源学说（endosymbiosis
