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1、微生物的基本知识回顾 1 什么是微生物 微生物 microorganism microbe 是一类个体微小 结构简单 肉眼不可见或看不清楚的微小生物的统称 2 微生物的特点 个体微小 结构简单 细胞大小以微米和纳米计量 种类繁多 分布广泛 一克沃土中含菌量高达几亿甚至几十亿生长繁殖快 代谢能力强 大肠杆菌 Escherichiacoli 在适宜的条件下 每20分钟即繁殖一代 24小时即可繁殖72代 遗传稳定性差 容易发生变异 自发突变频率为10 6左右 细菌的性质 1菌体形态 球 杆 螺旋 革兰氏染色 1884年丹麦医师Gram所发明 真细菌根据细胞壁结构分为革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 约40
2、层网状肽聚糖覆盖在细胞表面 磷壁酸贯穿于肽聚糖层 形成厚约20 80nm的细胞壁 磷壁酸贯穿其中 革兰氏阳性菌 G 细胞壁结构 内壁层 靠近细胞膜 为1 2层网状肽聚糖 外壁层 脂多糖 LPS 磷脂层和脂蛋白层 革兰氏阴性菌 G 细胞壁结构 脂多糖的结构模型 O 特异侧链核心多糖类脂A 内毒素 热源质 细菌的特出结构 芽孢 在其生长的一定阶段在细胞内形成圆形或椭圆形 圆柱形休眠体结构称为芽孢 功能 对恶劣环境有很强的抵抗能力 有的芽孢 在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久 它本身具有一个细胞维持生命的所有功能 特点 耐高温 抗热性很强 抗化学药物和酸类 对溶菌酶有抗性 细菌的特出物质 热原
3、质 特点 耐高温 不具挥发性 重要疏水原理 易被强酸 强碱破坏 可滤过性 易吸附性 可稀释性 水溶性 内毒素 细胞壁外层 属于细胞壁的组成部分 脂质A 一般与细胞结合在一起不分泌到环境中 只有当细菌溶解 裂解 后才释放出来 故称内毒素 少量内毒素0 001 g入血即可引起发热反应 内毒素被吞噬细胞吞饮后 细胞释放出内源性致热原 经血流到达下丘脑 体温调节中枢引起发热 作用特点 没有组织器官的选择性肌体发热 腹泻 出血性休克或其他组织损伤不能经甲醛脱毒 2 菌落 colony 单个 或聚集在一起的一团 微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长 繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的 有一定形态结构的子细
4、胞生长群体 菌落单位为CFU Colony FormingUnits 众多菌落连成一片 菌苔 lawn 通常情况下 纯培养能较好地被研究 利用和重复结果 因此 把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离 纯化出来的纯培养技术是微生物学研究的基础 3细菌纯培养的群体生长规律 把一定微生物接种到一定量的液体培养基中 在一定条件下进行一次性培养 定时取样测定活菌数 以活菌数的对数值为纵坐标 以培养时间为横坐标 就可以画出一条有规律的曲线 这就是微生物的典型生长曲线 繁殖曲线 一般把典型生长曲线划分为适应期 对数增长期 指数期 稳定期和衰亡期等四个时期 球菌 直径 0 5 1mm杆菌 直径 长度 0
5、2 1mm 1 5mm 青霉的分生孢子头 根霉的孢子囊和孢囊孢子 酵母菌是对一类单细胞真菌的通称 有球形 卵形 椭圆形 圆柱形等 大小在5 20 m 霉菌的细胞呈分枝或不分枝的丝状 直径约2 10 m 细菌菌落放线菌菌落霉菌菌落 酵母菌 2010年版中国药典微生物检验主要增修订内容 1 培养基的质量控制2 菌种的质量控制 1 微生物检验培养基质量控制技术 培养基是微生物试验的基础 直接影响微生物试验结果 适宜的培养基制备方法 贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证 1 1培养基制备过程中的注意事项 1 1 1培养基的水化培养基水化时不得用铜锅或铁锅 以防有离子混入培养基中 影响微生物的生
6、长 配制培养基最常用的溶剂是纯化水 不能含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质 培养基制备过程中的注意事项 1 1 2培养基的溶解在培养基分装灭菌前 各成分应溶解均匀 使用电炉等设备煮沸培养基时 应用小火加热 并边加热边搅拌 避免培养基焦化或爆沸溢出 培养基制备过程中的注意事项 1 1 3培养基的灭菌已配制好的培养基必须立即灭菌湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间 培养基制备过程中的注意事项 1 1 4培养基的pH微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性 调整培养基的pH 应用1mol LNaOH或1mol LHCl调整pH 一般灭菌前比最终pH高0 2 0 3 培养基制备过
7、程中的注意事项 1 1 5培养基的保温灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度 避免长时间保存在灭菌锅内 造成过度灭菌 影响培养基的营养成分或选择性效果 1 2培养基质量控制 2010版药典 培养基适用性检查 计数培养基 控制菌检查用培养基 1 2 1培养基适用性检查的基础 一 对照培养基系指按培养基处方特别制备 质量优良的培养基 用于培养基适用性检查 由中国药品生物制品检定所研制及分发 二 定量质控菌株 BioBall BioBall是由生物梅里埃BTF公司生产的定量质控标准菌株 其水溶性球状物包含了数量精确的微生物个体 主要用于培养基生长能力验证 无菌控制 微生物限度检查 抑菌效力检查 阳性对
8、照 方法验证 能力验证和MOU测定等试验 广泛用于制药工业 食品工业 水及废水检测和其他相关行业的微生物质控 目前 BioBall有超过25种常用的检测标准菌种 可提供SingleShot MultiShot 550 HighDose 10K和MultiShot 10E8四类系列产品 分别含有28 30cfu 标准误差小于或等于3cfu 500 600cfu 8000 12000cfu和0 7 1 5x108cfu数量的孢子 芽孢或细胞 1 2 2计数培养基适用性检查 大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉白色念珠菌 营养琼脂培养基NutrientAgar NA 玫瑰红钠琼脂培养
9、基 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 YPD YeastPeptoneDextroseAgar 50 100CFU 1 2 2计数培养基适用性检查 结果判定被检培养基上的菌落平均数对照培养基上的菌落平均数菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致 70 菌落计数法证明培养基生长能力USP USP要求每批配制培养基作促生长能力测试菌种选择 变化大 每个微生物单独测试大豆酪蛋白消化培养基 金葡 铜绿 枯草沙堡葡萄糖培养基 白念 黑曲方法 在培养中加入少量中 不超过100cfu 的微生物 按要求培养 对于新鲜制备的菌液 生长与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致 标准 计数结果与标准接种物的计算量差别小
10、于系数2 即计数结果在标准接种物数量的50 200 1 2 3控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力抑制能力指示能力 检查项目 1 2 3控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力检查 增菌培养基促生长能力检查 分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中 在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养 与对照培养基管比较 被检培养基管试验菌应生长良好 培养基基本要求 1 2 3控制菌检查用培养基适用性检查 促生长能力检查 固体培养基促生长能力检查 取试验菌各0 1ml 含菌数50 100cfu 分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上 在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培
11、养时间下培养 被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致 培养基基本要求 USP控制菌检查用固体培养基能力检查 使用表面涂布法 在培养中加入少量中 不超过100cfu 的微生物 在规定温度下培养不超过规定的最短时间 清楚的观察到与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致 注 有生长就行 无数字上要求 1 2 3控制菌检查用培养基适用性检查 抑制能力检查 培养基抑制能力检查 接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基中 在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养 试验菌应不得生长 针对选择性培养基 胆盐乳糖培养基 胆盐乳糖发酵培养基 四硫磺酸亮绿培养基 金黄色葡萄球菌 溴化十六烷基三
12、甲胺琼脂培养基 亚碲酸盐肉汤培养基 卵黄氯化钠琼脂培养基 甘露醇氯化钠琼脂培养基 念珠菌显色培养基 大肠埃希菌 1 2 3控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查 固体培养基指示能力检查 取试验菌各0 1ml 含菌数不大于100cfu 分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上 在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养 被检培养基中试验菌生长的菌落形态 大小 指示剂反应情况等应与对照培养基一致 针对鉴别培养基 1 2 3控制菌检查用培养基适用性检查 指示能力检查 液体培养基指示能力检查 分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中 在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下
13、培养 与对照培养基管比较 被检培养基管试验菌生长情况 指示剂反应等应与对照培养基一致 针对鉴别培养基 典型特征 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂 EMB 曙红亚甲蓝 上典型特征 典型特征 黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰红钠琼脂RoseBengalAgar上典型特征 典型特征 金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠MannitolSaltAgar琼脂上典型特征 典型特征 沙门氏菌在SS琼脂上 沙门氏菌在BS琼脂 亚硫酸铋琼脂 上 培养基质量控制 2010版药典 实验室配制的培养基的常规监控项目pH适用性检查试验定期的稳定性检查以确定有效期 2 菌种的质量控制2 1概念 标准菌株 由国内或国际菌种保藏机构保藏的 遗传学特性
14、得到确认和保证并可追溯的菌株 标准储备菌株 由标准菌株经一次传代得到的培养物 商业派生菌株 由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株 代 将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养 并希望获取新的微生物培养物 这种操作方式 新培养物对接种培养物而言就称为一代 工作菌株 由标准储备菌株经传代得到的培养物 中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株 美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株 法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株 Bioball 低温冷冻保藏的标准储备菌株 低温蜡封保藏的标准储备菌株 我所制备的工作菌株 中国药典2010年版在方法的附录中对菌种的规定同2005年版在新增的 药品微生物实验室规范指导原
15、则 中对菌种有了较为明确的规定允许使用标准菌株和商业派生菌株标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥 液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用工作菌株不可替代标准菌株 商业派生菌株仅可用作工作菌株 菌种鉴定简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定技术 如API鉴定条基本程序为 对疑似菌种进行纯培养进行染色镜检根据染色情况 并结合显色培养基等鉴定的初步信息 选择合适的鉴定条根据操作说明书 得到各生化反应的鉴定结果 通过查阅检索表 得到菌种鉴定的初步结果也可以采
16、用半自动或全自动的微生物鉴定系统 菌种的管理 菌种的采购菌种的复苏菌种的传代菌种的保藏菌种的使用和销毁 菌种的采购每年年底 由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划 计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种 填写请购单 经批准后 由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置 所购菌种均为冷冻干燥菌种 采购部门购入菌种后 应及时移交实验室 实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息 确认无误后 置4 6 暂存 浙江省食品药品检验所菌种管理程序 菌种的复苏菌种在打开前应仔细核对标签上菌名 菌号 并注意一株菌种使用一套打开用具 严防交叉污染 菌种复苏应在生物安全柜内操作 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 沙门菌 生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌 藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面 取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定 浙江省食品药品检验所菌种管理程序 菌种的传代应在生物安全柜中进行菌种的传代 取经过纯度鉴定的第1代菌种管 琼脂培养基斜面培养物 用于传代制备第2代菌种 接种完毕 液体培养基或琼脂
