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1、前言 目的片段与载体链接构建重组DNA分子 第1 3章 简单直接 常规高等生物DNA的复杂性 真核生物 真菌 昆虫 植物 动物 人类1 从复杂的基因组中分离单拷贝的基因 2 从来源于复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆 构建含完整基因组DNA或cDNA序列的有实用价值的重组DNA文库 主要问题是足够的克隆数 确保基因组DNA中每一个序列存在于文库中 注意 防污染策略 电话克隆 重组DNA文库的构建与筛选 2019 1 重组DNA文库的构建与筛选 内容 重组DNA技术的发展简史重组DNA技术的有关概念重组DNA的基本原理和流程重组DNA技术的应用 2019 2 重组DNA文库的
2、构建与筛选 内容 简史概念重组DNA的基本原理应用 2019 3 重组DNA文库的构建与筛选 重组DNA技术来源 限制性核酸内切酶 1952年美国分子遗传学家S E 卢里亚在大肠杆菌中发现一种所谓限制现象 从菌株甲的细菌所释放的噬菌体能有效地感染同一菌株的细菌 可是不能有效地感染菌株乙 少数被感染的菌株乙的细菌所释放的同一噬菌体能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲 1974年美国学者W 阿尔伯对这一现象提出了解释 认为通过噬菌体感染而进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解 细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰 甲基化 而免于被分解 但有少数噬菌体在没有被分解以前已被修饰了 这些噬菌体
3、经释放后便能有效地感染同一菌株的细菌 被甲 或乙 这一菌株所修饰的噬菌体只能有效地感染甲 或乙 而不能有效地感染乙 或甲 说明各个菌株对于外来DNA的限制作用常常是专一性的 通过进一步的研究发现这种限制现象是由于细菌细胞中具有专一性的限制性核酸内切酶的缘故 2019 4 限制性核酸内切酶的发现 三位科学家由于限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用 为遗传工程的产生拉开了序幕而获得1978年诺贝尔生理学或医学奖 重组DNA文库的构建与筛选 2019 5 重组DNA文库的构建与筛选 重组DNA技术来源 基因载体 重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体 它是在1951年由美国
4、学者E 莱德伯格等发现的 英国微生物遗传学家W 海斯和美国微生物遗传学家J 莱德伯格等在1952年首先认识到大肠杆菌的F因子是染色体外的遗传因子 1953年法国学者P 弗雷德里克等发现大肠杆菌产生大肠杆菌素这一性状为一种染色体外的大肠杆菌素因子所控制 1957年日本学者发现了抗药性质粒 都是在遗传工程中广泛应用的质粒 实际应用中的载体几乎都是经过改造的质粒或温和噬菌体 2019 6 重组DNA文库的构建与筛选 重组DNA技术来源 生物化学研究 1972年是基因工程的诞生之年 美国斯坦福大学P Berg将SV40的DNA导入噬菌体载体在大肠杆菌中获表达 S Cohen等人将抗四环素 新霉素基因的
5、质粒转化大肠杆菌 获得抗四环素 抗新霉素重组菌落 从而揭开基因工程的序幕 1973年美国分子生物学家S N 科恩等将几种不同的外源DNA插入质粒pSC101的DNA中 并进一步将它们引入大肠杆菌中 从而开创了遗传工程的研究 1997年2月23日 克隆羊 多利 在英国诞生 世界为之震动 这是基因工程技术上划时代的突破 2019 7 重组DNA文库的构建与筛选 内容 简史概念重组DNA的基本原理应用 2019 8 重组DNA文库的构建与筛选 基因库 基因文库 基因库 包含特定基因组所有基因 DNA区段的全部分子克隆的集合体 根据分子克隆中所含核酸片段的类型 基因库可分为 核基因库 染色体库 cDN
6、A库和线粒体库等 2019 9 重组DNA文库的构建与筛选 基因组DNA文库存在于转化细菌内 由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 简称G 文库 2019 10 重组DNA文库的构建与筛选 cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后 建立的基因文库 简称c 文库 2019 11 重组DNA文库的构建与筛选 2019 12 重组DNA文库的构建与筛选 重组DNA技术实现基因克隆所采用的方法及相关的技术操作 称为重组DNA技术 recom binantDNAtechnology 或基因工程 广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作 细胞工程 和分子水平上的遗传操作 即重组DNA技术 有人
7、称之为基因工程 狭义的遗传工程则专指后者 2019 13 转基因技术 Transgenetechnology 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中 由于导入基因的表达 引起生物体的性状的可遗传的修饰 经转基因技术修饰的生物体常被称为 遗传修饰过的生物体 Geneticallymodifiedorganism 简称GMO 重组DNA文库的构建与筛选 2019 14 重组DNA文库的构建与筛选 克隆 clone 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 分子克隆 DNA克隆 细胞克隆个体克隆 动物或植物 克隆化 cloning 获取同一拷贝的过程 即无性繁殖 2019 15 重组DNA文库的构建
8、与筛选 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 识别DNA的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 2019 16 重组DNA文库的构建与筛选 cDNA complementaryDNA 经反转录合成的 与RNA互补的单链DNA 以单链cDNA为模板 经聚合反应可合成双链cDNA 2019 17 重组DNA文库的构建与筛选 基因组genome一种生物体具有的所有遗传信息的总和 基因组DNA genomicDNA 代表一个细胞或生物体整套遗传信息 染色体及线粒体 的所有DNA序列 2019 18 重组DNA文库的构建与筛选 目的基因 靶基因 应用重组D
9、NA技术分离 获得某一感兴趣的基因或DNA序列 有时是获得感兴趣基因的表达产物 蛋白质 2019 19 重组DNA文库的构建与筛选 基因载体 克隆载体 为 携带 感兴趣的外源DNA 实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 其中 为使插入的外源DNA序列可转录 进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体 质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA 2019 20 重组DNA文库的构建与筛选 感受态细胞经一定方法处理 如CaCl2处理 后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌 2019 21 重组DNA文库的构建与筛选 转化 transformation 将重组DNA分子引入细菌 原
10、核细胞 使其在细菌体内扩增及表达的过程 2019 22 重组DNA文库的构建与筛选 转染 transfection 将噬菌体 病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程 2019 23 重组DNA文库的构建与筛选 感染以噬菌体为载体 在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒 使其感染受体菌 2019 24 重组DNA文库的构建与筛选 质粒 plasmid 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 大小约为数千碱基对 常有1 3个抗药性基因 以利于筛选 2019 25 mRNA丰度 一种特定的mRNA在某个细胞中的平均分子数 分类 高丰度mRNA 通常有100种左右的不同的mRNA 每
11、种mRNA的拷贝数在1 000至10 000间 低丰度mRNA 包括约10 000种mRNA 每种的拷贝数在1至10间 重组DNA文库的构建与筛选 2019 26 重组DNA文库的构建与筛选 内容 简史概念重组DNA的基本原理应用 2019 27 基因组DNA文库 指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段 与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落 通常采用放射性同位素标记的核酸探针进行杂交筛选 主要的问题是如何产生足够数量的重组DNA克隆 重组DNA文库的构建与筛选 2019 28 代表性和随机性 代表性是指文库中所有克隆所携带的D
12、NA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组 即可以从该文库中分离任何一段DNA 代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标 构建策略 采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA 以保证克隆的随机性 保证每段DNA在文库中出现的频率均等 提高文库所含基因组DNA的总容量 通常用覆盖基因组的倍数来衡量为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目 Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式 N ln 1 p ln 1 f N 代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p 表示所期望的目的基因在文库中出现的几率f 表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值 重组DNA文库的构建与筛
13、选 2019 29 重组DNA文库的构建与筛选 重组DNA技术基本原理 2019 30 原始材料的选择 任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因 所以在构建cDNA文库时应根据研究目的的不同而选用不同的生物材料作为RNA分离的出发材料 有些甚至要经过特殊的诱导处理以提高所需DNA的丰度 重组DNA文库的构建与筛选 2019 31 重组DNA文库的构建与筛选 重组DNA技术的基本步骤一 目的基因的获得和载体的选择二 目的基因与载体的连接三 重组DNA分子导入受体细胞四 筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆五 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化 2019 32 重组DNA文库
14、的构建与筛选 基因工程技术策略 分 基因载体目的基因质粒噬菌体病毒直接分离cDNA人工合成基因文库切 限制性内切酶有缺口的载体目的基因接 连接酶粘端连接平端连接尾接法重组体转 转化转染体外包装带重组体的宿主筛 表型筛选电泳法核酸杂交 2019 33 重组DNA文库的构建与筛选 一目的基因的制备 反转录 应用得最多的获取目的基因的方法 前提是目的基因的序列已知 至少部分已知 真核细胞的基因多数为单拷贝 难于分离到足够的目的基因 2019 34 重组DNA文库的构建与筛选 二载体的选择 2019 35 重组DNA文库的构建与筛选 基因工程的重要工具 载体 vector 目的基因进入原核或真核细胞并
15、高效复制和表达蛋白质 需要装入载体才能实现 2019 36 重组DNA文库的构建与筛选 载体 用于承载 克隆 转移目的基因 DNA片段 能自我复制的DNA分子 在基因克隆时 将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆 克隆载体 在基因导入受体时 将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达 转化载体或表达载体 常用基因工程载体有 细菌质粒 克隆 噬菌体 克隆 柯斯质粒 克隆 穿梭质粒 克隆 表达 细菌人工染色体 克隆 表达 酵母人工染色体 克隆 表达 Ti质粒及其衍生载体 转化 2019 37 重组DNA文库的构建与筛选 载体的选择标准 具有自主复制和表达的能力 具有两个以上的遗传标记物 便于重组体的
16、筛选和鉴定 有克隆位点 外源DNA插入点 常具有多个单一酶切位点 称为多克隆位点 分子量小 以容纳较大的外源DNA 载体与宿主细胞容易分离和纯化 2019 38 重组DNA文库的构建与筛选 载体的特征与功能 特征功能在宿主细胞内稳定允许复制能控制自身复制在细胞内复制高拷贝数大小较小容易转化 进入宿主细胞存在限制性内切酶单一允许供体DNA插入和质粒环化酶切位点不能通过接合转移阻止重组DNA进入菌群易于检测的特性 具有可以区分转化和未转化细胞两个以上的检测位点容易从细胞中分离容易得到高产量重组体 2019 39 DNA文库载体的种类和特征 重组DNA文库的构建与筛选 2019 40 病毒表达系统 重组DNA文库的构建与筛选 2019 41 重组DNA文库的构建与筛选 保证获得数量足够的高质量的起始RNA反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键构建cDNA文库中最贵的一步 也是核酸质变的一步 它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA cDNA文库 2019 42 重组DNA文库的构建与筛选 五重组子的筛选和鉴定 2019 43 重组DNA文库的构建与筛选 重组体的筛选重组DNA导入受体菌后
