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1、铁细菌的快速检测试剂瓶的研制1前言铁细菌在含铁的淡水中分布广泛，好气，嗜中性环境。由于它能氧化溶解于水中的氢氧化亚铁，碳酸铁成高铁形式沉积下来，起到浓缩和积累环境中铁的作用，是天然褐铁矿的参与者。另外，由于这类菌能使水中亚铁化合物氧化成红棕色粘性物(Fe2O3xH2O)，从而在铁管中形成软泥它也是危害水系统最重要的微生物之一1,2。在工业用水中，如果铁细菌大量滋生，将产生大量覆盖在金属表面上的氢氧化铁鞘层。这不仅降低了热传导效率，而且会造成金属管道的管径缩小或堵塞，降低水流量，使水质变差，同时造成电腐蚀并为硫酸盐还原菌提供极为有利的生长条件。因此铁细菌是循环冷却水中的一种必检菌3。在油田注水开
2、发中，由于其注水的温度和环境均适合铁细菌的生长繁殖。而该菌类的大量生长和繁殖又会造成注水管线、注水设备的腐蚀及堵塞。同时腐蚀产物、菌体及其代谢产物还会堵塞地层、降低地层渗透率、增加注水压力，对油田开发极为不利世界上许多产油国都投入了相当的资金和技术 ,致力于铁细菌的研究。目前，铁细菌的快速检测方法包括：测试瓶绝迹稀释法，镜检法，MPN法，荧光检测法等。其中，测试瓶绝迹稀释法是目前国内外最为常用的测定方法。铁细菌的检测方法通常是采用中石化总公司生产部、发展部编制的冷却水分析和试验方法中的208与GB/T 14643.693。两法大同小异,均是采用试管稀释法，操作繁琐、费时4,5,6。因此，如何快
3、速准确地测定出铁细菌含量，以便适时采取措施，有效地控制其生长和繁殖、避免或减少铁细菌的危害,对油田生产具有非常重要的现实意义。1.1 铁细菌作用的机理铁细菌是一种好气异养菌，在含气量小于0.5 mg/L 的系统中也能生长。铁细菌的生长需要铁。但对铁浓度的要求并不高和苛刻 ,在生长需要铁 ,但对铁浓度的要求并不高和苛刻 ，该菌以有机物为营养源 ,其生长需要有机物 ,偏爱铁与锰的有机化合物. 这类有机物被利用后 ,铁和锰被作为废物排出 ,附着于细菌的丝状体上. 铁细菌是好氧菌 ,在静止水中 ,完全缺铁的深层是很难生长和繁殖的，在流动的水中有一定的溶解氧 ,铁细菌仍能生长。凡是具有以下生理特征的为典
4、型的铁细菌 , 即:能在氧化亚铁成高价化合物中起催化作用;可以利用铁氧化中释放出来的能量满足其生命的需要;能大量分泌氢氧化铁成基定形结构. 铁细菌偏好铁质较多的酸环境 ,以碳酸盐为碳源: 4FeCO3 +O2 +6H2O4Fe(OH)3 +4CO2 +能量7，反应产生能量和高铁维持其能量代谢. 不溶性，Fe(OH)3经菌体排出后,形成大量棕色粘泥.铁细菌在酸性环境中对其发育有利 碱性水中不适宜铁细菌生长,其适宜的pH值为68,所需温度偏低,最适菌生长,其适宜的pH值为68。1.2 铁细菌的快速检测方法1.2.1 测试瓶绝迹稀释法 目前,测定水中铁细菌含量的方法有很多种,其中,测试瓶绝迹稀释法是
5、目前国内外最为常用的测定方法。它被认为是目前测定方法中既简单方便又比较准确可靠的方法8,9。其原理是将欲测定的水样用一次性使用无菌注射器逐级注入到测试瓶中进行接种稀释,放入恒温培养箱中培养。根据细菌瓶阳性反应和稀释的倍数，计算水样中细菌的数目。具体做法是将欲测定的水样用一次性使用无菌注射器逐级注入到测试瓶中进行接种稀释后,将其放入恒温培养箱中,培养温度控制在现场水温的5，铁细菌培养7d后读数。如果铁细菌测试瓶中液体出现棕红色沉淀,即表示有铁细菌。其菌量依据中国石油天然气总公司行业标准SY/T532994计量10,11。1.2.2 培养-镜检法 其基本原理为将经过短期培养的铁细菌进行染色,并依据
6、其在生物显微镜下的特定形状、形态即可进行快速测定。铁细菌呈螺旋杆状、球状或杆状到椭圆状。待测水样中的铁细菌在测试瓶中经短期培养后,铁细菌的数量会大大增加。这时即可取出测试瓶中的培养液进行简单的染色镜检观察,而勿需等待培养液出现棕红色沉淀,从而可达到快速准确测定铁细菌量的目的。根据上述培养镜检法的基本原理，在大量试验研究工作的基础上，选择了草酸铵结晶紫作为铁细菌的染色剂,培养温度控制在现场水温5内,测定铁细菌所需时间仅为1天12,13。1.2.3 荧光原位杂交法 荧光原位杂交技术( fluorescencein situhybridization，FISH)的原理是根据已第 15 页 (共 17
7、 页)前言知微生物不同分类级别上种群特异的DNA或RNA分子序列，利用荧光标记的特异寡核普酸片段作为探针，依据碱基互补原理，与待测微生物基因组中DNA或RNA分子杂交，在一定激发波长的荧光显微镜下观察，对待测微生物种群进行定性、相对定量分析。荧光原位杂交技术作为一种在医学方面已经较为成熟的技术已经越来越多的应用到了环境微生物学当中。荧光原位杂交技术不依赖于对铁细菌微生物进行培养，而直接以铁细菌rRNA中高度保守、具有物种特异性的片断序列作为鉴别的标志14。设计和选择特异性探针以及荧光标记物质,通过探针与目标铁细菌的rRNA特异性片断进行杂交反应使目标铁细菌特异性地带有荧光标记。利用显微观察和计
8、数技术,快速、直观、准确地检测目标铁细菌在水样中的存在、数量和分布.利用多种特异性探针来解析环境样品中铁细菌的群落结构和生物多样性。了解环境中优势铁细菌的种类、数量和分布，从而可以根据对优势铁细菌的种群的作用来促进、抑制和调控环境中其他微生物群落，达到指导生产的目的15。目前，清华大学吴晓磊、屈睿、晏芸几人发明了涉及铁氧化细菌（Iron bacteria, IB）检测的组合基因探针及其检测方法。该组合基因探针由IB中的个基因序列的两种或两种以上组合而成，该检测方法为取水样品，用异多醛溶液固定该水样品中的微生物细胞；滴入载玻片中，进行干燥、脱水后加入所述的组合基因探针溶液，再加入Nacl和甲酰胺
9、的杂交溶液；杂交后，用磷酸盐缓冲溶液清洗该载玻片上的探针溶液，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品，后干燥；用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的IB细胞进行计数。本发明能够对油田回注水中IB快速、全面、精确、便捷地检测，可以实现对采油过程及时、准确的调控。1.2.4 MPN法 1915年，McCrady首次发表了用MPN法(最大可能数法)来估算细菌浓度的方法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法16。目前，我国仍普遍将MPN法用于大肠菌群，大肠杆菌等微生物的检测，该法对实验室的微生物检测及食品工业和环境微生物的控制都有着重要的指导作用。我们也常用MPN法对工业循环水，原水、生活
10、用水及粘泥中铁细菌铁细菌的测定。首先用生理盐水将检样进行10的系列稀释，选择3个连续稀释度，每个稀释度各接种到3支装有柠檬酸铁铵固体培养基的试管中。根据初次培养结果，将阳性管在铁细菌的柠檬酸铁铵的固体培养基上选择性平板分离，选择培养基上的铁细菌菌群典型菌落（黄色或红色菌落）进行确证试验，由阳性管数查MPN检索表，得到MPN值17。1.3 铁细菌的处理本文前面已经介绍了铁细菌快速检测方法(测试瓶绝迹稀释法、镜检法、荧光原位杂交法、MPN法)，在生产实践中，我们应该根据实际情况从中选择一种最适合的方法来快速检测铁细菌从而对其采取相应的措施。控制铁细菌生长最常用的方法是投加杀菌剂。细菌的生命力极强，
11、长时间使用任何一种杀菌剂都会使细菌产生抗药性，引起杀菌剂的杀菌效率下降、药量增加等问题。因此，杀菌剂首要的性能是应具有良好的杀生性能。此外，良好的杀菌剂还应有以下特征：广谱性、剥离黏泥和藻层的能力、不污染环境、抗氧化性、与其他水质稳定剂的相容性和较宽的pH适应范围。按药剂杀生机制,杀菌剂可分为两类:即氧化性杀菌剂(如Cl2、ClO2、漂粉精、过氧化物等)和非氧化性杀菌剂(如季铵盐等) 18,19,20。杀菌剂的作用机理主要有以下四类:阻碍菌体的呼吸作用;抑制蛋白质合成；破坏细胞壁；阻碍核酸的合成。杀菌剂种类很多。杀菌机理也各不相同，但凡具备以上条件之一者，均能使细菌被抑制或致死。目前，国内油田
12、回注水杀菌处理方法主要有投加次氯酸钠、二氧化氯、氯气、以及电磁杀菌、紫外线杀菌等。国内还有利用各类杀生剂及活性酶之间的协同作用复配而成非氧化性杀生剂,如有机硫类化合物活性酶与季铵盐等复配,用于工业循环冷却水的杀菌灭藻，粘泥剥离等均有显著的效果，是新一代的非氧化性的杀生剂。这些不同的杀菌工艺与技术应用于不同的杀菌领域，都有一定的适应性、针对性和局限性21,22。尽管国内一些主要的研究油田注水杀菌剂的机构对新型杀菌剂进行了进一步的研究与开发，但面对油田水复杂的处理环境，这方面的研究还没有大的突破。因此，面对油田注水规模的扩大，对于杀菌剂今后的发展，应有更多的高材料与方法等院校和科研院所联合参与，在
13、对铁细菌的快速检测方法进一步探索的基础上，加强基础理论的研究，从而提出更新更适用的杀菌抑菌措施，这对于油田生产、工业生产以及人类日常生活都具有重要的现实意义23。1.4 研究内容及展望以上分别简单的介绍四种快速检测铁细菌的方法中，测试瓶绝迹稀释法由于其测定铁细菌需要七天，所需时间太长，在实际油田生产中往往不可取。培养-镜检法由于在操作过程需要用到生物显微镜等各种特殊的生物器材也往往不实际。荧光原位杂交技术常常因为其在样品处理以及杂交过程中的多种影响因素譬如探针难以制备，操作繁琐和复杂，费用高等都制约了其前进的脚步。而MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述菌落浓度的一种间接计数法。虽然实
14、验结果以MPN值表示，但是MPN值并不能表示实际菌落数，而实际菌落数落在置信区间内的任何一点；MPN法也是一种常见的间接计数法，其存在有一定的局限性，且该法操作极为繁琐、费时，包括清洁玻璃器皿、培养基的配制与灭菌、分装等一系列复杂过程，且要求无菌操作13。因此，本实验研究目在于研制出一种新型针对水质中铁细菌的检测装置。它是一种带有营养成分的测试瓶，包括玻璃瓶、橡胶瓶盖等，其特征是内部提供充氧的液体环境。该测试瓶是通过本实验室重复试验优化得到铁细菌的最适培养基,然后通过该培养基对铁细菌的培养一定时间而呈现浑浊或沉淀现象的铁细菌水质测试瓶。（语言不通）该测试瓶的主要特点为：1、经过重复试验得到优化
15、的铁细菌培养基，促使铁细菌迅速生长。2、缩短检测周期，正常操作下，可在一周内出结果。3、采用三瓶重复法，得到的结果精确。4、操作简单，易于推广。与以上四种方法相比，用该测试瓶检测铁细菌，具有成本投入少,检测周期短，较精确的检测灵敏度等优点，能更好的适用于油田生产和工业生产。2 材料与方法2.1 样品试剂及实验仪器 硫酸铵 硝酸钠 MgSO47H2O CaCl22H2O K2HPO4 柠檬酸铁铵 250mL三角瓶空的医药检测瓶起子1mL移液枪 1mL移液枪头 超净台恒温箱2.2 水样实验所需水样由老师提供，来自于江汉油田现场采集。2.3 方法2.3.1 铁细菌的培养基的配置（每段开头，空两格即可，后面的格式自己修改下,标题注意对齐）按照优化后的铁细菌检验用的培养基(柠檬酸铁铵培养基)配方：(NH4)2SO4 0.5g、NaNO3 0.5g、K2HPO4 0.5g、CaCl22H2O 0.2g、MgSO47H2O 0.5g、柠檬酸铁铵10g、DH2O 1000 ml，最后调PH（pH）为自然，高压蒸汽灭菌30 min，冷却待用。2.3.2 铁细菌的检测 步骤一：在无菌的条件下，将已灭过菌的铁细菌液体培养基分别分装9 ml于16支测试瓶中（该测试瓶事先均已灭菌）。步骤二：铁细菌测定推荐采用三瓶重复法，即一个稀释度作三瓶重复。将以上装有液
