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1、 第二节基因工程的原理和技术 重组质粒或重组DNA 传统的生产胰岛素的方法只能从猪和羊的胰腺中提取 获得1g胰岛素大约需要100Kg的猪胰脏 糖尿病治疗 1978年 科学家在大肠杆菌中成功表达了人胰岛素 并于1982年被美国批准上市 基因工程的基本原理 让人们感兴趣的基因 目的基因 在宿主细胞中稳定和高效表达 基因工程的基本操作程序 1 获得目的基因 2 形成重组DNA分子 3 将重组DNA分子导入受体细胞 4 筛选含有目的基因的受体细胞 5 目的基因的表达 目前被较广泛提取使用的目的基因有 苏云金杆菌抗虫基因 人胰岛素基因 人干扰素基因 种子贮藏蛋白基因 植物抗病基因等 基因操作的基本步骤
2、一 提取目的基因 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来 目的基因的序列未知1 从基因文库中获取目的基因的序列已知2 利用聚合酶链式反应 PCR 技术扩增3 人工合成 获取目的基因的常用方法 1 基因文库的构建 直接分离法 或鸟枪法 该法最大的缺点是带有很大的盲目性 工作量大 成功率低 且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去 2 利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应 在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 可以获得大量的目的基因 PCR扩增仪 氢键断裂 形成单链DNA 引物与DNA模板结合 形成局部双链 在酶的作用下 不断延伸 合成双链DNA 多次循环 获得大量双链DNA分子 PC
3、R技术扩增 人工合成法 逆转录法 根据已知氨基酸序列直接合成DNA 二 形成重组DNA分子 核心 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种 一个切口两个黏性末端 目的基因与质粒的连接 三 将重组DNA分子导入受体细胞 1 常用的受体细胞 有大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 酵母菌和动植物细胞等 探究 转基因过程中 怎样选择受体细胞 转基因植物 转基因动物 转基因微生物 植物体细胞或受精卵 受精卵 大肠杆菌 枯草杆菌 酵母菌等 探究 为什么常用微生物作为受体细胞 目的基因导入受体细胞后 就可以随着受体细胞的繁殖而复制 由于细菌繁殖的速度非常
4、快 在很短的时间内就能够获得大量的目的基因 微生物可通过发酵大量繁殖 2 将目的基因导入微生物细胞 受体细胞 细菌 氯化钙 细胞壁的通透性增大 重组质粒进入受体细胞 目的基因随受体细胞的繁殖而复制 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 基因枪法又称微弹轰击法 是利用压缩气体产生的动力 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中 使目的基因与其整合并表达的方法 将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 提纯基因表达载体 1 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 2 将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 最多 最有效 3 将目的基因导入微生物细胞 Ca2 处理
5、 以增加细菌细胞壁的通透性 探究 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来 1 原理 2 方法 3 举例 所有受体细胞 四 筛选有目的基因的受体细胞 质粒上有抗生素的抗性基因 利用选择培养基筛选 筛选含有目的基因的受体细胞 前三步的处理十分繁锁 为保证目的基因得到有效利用 通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因 这样 处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少 必须将它从中检测出来 细菌的检测 将每个受体细胞单独培养形成菌落 检测菌落中是否有目的基因的表达产物 淘汰无表达产物的菌落 保留有表达产物的进一步培养 研究 多细胞生物的检测 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体 检测这些个体是否摄
6、入目的基因 摄入的基因是否表达 是否表现出相应的性状 淘汰无变化的个体 保留有相应变化的个体进一步培养 研究 例 用棉铃饲喂棉铃虫 如虫吃后不出现中毒症状 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达 如虫吃后中毒死亡 则说明摄入了抗虫基因并得到表达 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因一定能完成表达吗 含有目的基因的受体细胞不一定都能表达 五 目的基因的表达 看到目的性状或分离到目的基因表达产物 外源基因在受体细胞内表达的理论基础 基因是控制生物性状的基本单位生物界共用一套遗传密码遗传信息的传递都遵循中心法则的信息流动方向 人胰岛素原基因在大肠杆菌中只能表达和人胰岛素原 要经进一步的加工后才能获
7、得具生物活性的胰岛素 甲生物 乙生物 新类型 基因敲除技术 转基因技术 生物 新类型 能力提升 人的糖蛋白必须经过内质网和高尔基体进一步加工合成 通过转基因技术 可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是 A大肠杆菌B酵母菌CT4噬菌体D质粒DNA B 知识延伸 DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则 把互补的双链DNA解开 把单股的DNA小片段用同位素 荧光分子或化学发光催化剂等进行标记 之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交 从而检出所要查明的DNA或基因 基因探针 DNA探针 与目的基因杂交 有无杂交带 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 形成重组DNA分子 将目的基因导入
8、受体细胞 筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因表达 1 从基因文库中获取目的基因2 利用PCR技术扩增目的基因3 化学方法人工合成 农杆菌转化法 基因枪法 显微注射法 Ca2 处理法 DNA分子杂交技术 抗原 抗体杂交技术 分子检测外的个体水平鉴定 四 本节小结 例如 将每个受体细胞单独培养形成菌落 检测菌落中是否有目的基因的表达产物 淘汰无表达产物的菌落 保留有表达产物的进一步培养 研究 1 用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质 下列叙述不正确的是A 常用相同的限制性内切酶处理的基因和质粒B DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C 可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导
9、入了重组质粒D 导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达 B 巩固练习 2下列属于获取目的基因的方法的是 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A B C D D 3基因工程又叫基因拼接技术 1 在该技术中 用人工合成方法获得目的基因的途径之一是 以目的基因转录的为模板 成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成 2 基因工程中常用的受体细胞有细菌 真菌 3 假设以大肠杆菌质粒作为运载体 并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因 将切割后的运载体与目的基因片段混合 并加入DNA连接酶 连接产物至少有种环状DNA分子 它们分别是 信使
10、RNA 逆转录 双链DNA 目的基因 动植物细胞 3 运载体自连的 目的基因片段自连的 运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子 4如何利用目的基因 通过转基因技术获得抗寒能力提高的香蕉植株 在运用转基因香蕉的过程中 在生态安全方面可能会出现什么问题 列举两点 将目的基因插人土壤农杆菌的质粒 构建表达载体 通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞 成功转化的香蕉细胞通过组织培养形成植株 生态安全问题包括 外源基因扩散到其他物种 外源基因漂移 转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能 转基因植株扩散对生物多样性的影响 转基因植物残体或分泌物对环境的影响 四 筛选含有目的基因的受体细胞 五 目的基因的表达
11、四 基因工程的基本操作步骤 步骤一获得目的基因 人工合成 利用PCR技术扩增 已知序列 从基因文库获得 未知序列 DNAlibrary 聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction 化学合成 鸟枪法 从基因文库获得 PCR技术 原理 前提 条件方式 DNA复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 指数 2n 模板DNA 两个DNA引物 四种脱氧核苷酸 热稳定DNA聚合酶 Taq酶 过程 变性 退火 延伸三步曲 变性 加热至90 95 双链DNA解链成为单链DNA退火 冷却至55 60 部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸 加热至70 75 以目的基因为模板 合成互补的新DNA链 目的基因的检测与表达 检测 导入检测 目的基因是否导入受体细胞 方法 DNA分子杂交 表达检测 转录检测 分子杂交 翻译检测 抗原抗体杂交 分子检测法 鉴定 抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等 个体水平的鉴定
