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1、 第二章基因工程与食品科学 概述基因工程定义是指按人们的需要 用类似工程设计的方法将不同来源的基因 DNA分子 在体外构建杂种DNA分子 然后导入受体细胞 并在受体细胞内复制 转录和表达的操作 又称为DNA重组技术 基因工程的实施包括四个必要的条件 工具酶 基因 载体和受体 基因工程的内容和方法主要内容 分离制取带有目的基因的DNA片段 在体外 将目的基因连接到行当的载体上 将重组的DNA分子导入受体细胞并扩增繁殖 从大量的细胞繁殖群体中 筛选出获得了重组DNA分子的重组体 外源基因的表达和产物的分离和纯化 主要方法密度梯度离心 DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 DNA
2、序列结构分析以及人工合成 基因定点突变和PCR扩增等多种新技术 新方法 基因工程的分子生物学基础脱氧核糖核酸DNA变性 复性和杂交DNA的复制DNA的修复生物的基因重组基因遗传信息的传递方向 脱氧核糖核酸生物的遗传物质是DNA DNA是由大量的脱氧核糖核苷酸组成的线状或环状生物大分子 由碱基 磷酸 戊糖组成 碱基由腺嘌噙 A 鸟嘌噙 G 胞嘧啶 C 与胸腺嘧啶 T 组成 DNA变性 复性与杂交DNA变性 DNAdenaturation 在高温及强碱长期保持下 双链DNA分子氢键断裂 两条链完全分离 形成单DNA分子 复性 renaturation 或退火 annealing 变性DNA分子经处
3、理又可重新形成天然DNA分子 这个过程称 降低温度 pH及增加盐浓度均可促进DNA的复性 杂交 hybridization 当复性DNA分子由不同的两条链分子形成时 这种复性称为 DNA的复制复制是一个复杂的过程 可参看有关书籍 DNA复制特点 从特定的开始并按特定的方向进行 5 3 DNA分子的复性是半保留复制 DNA分子的复制是半不连续复制 DNA分子的复制是通过DNA聚合酶及各种相关的酶蛋白 蛋白因子的协同有序的工作完成的 DNA分子复制具有高度的精确性和准确性DNA分子复制的速度 细菌 104 105核苷酸 min 而在真核细胞中为500 5000核苷酸 min DNA的修复DNA复制
4、时可能由于DNA聚合酶引发的偶然的错误 或者由于环境因素致使DNA产生序列上的错误 此时生物体内存在着的修复系统就会对DNA的变异起保护修复的作用 DNA修复主要包括三个步骤 DNA修复核酸酶对DNA双链上不正常的碱基的识别与切割 DNA聚合酶对已切割区域的重新合成 DNA连接酶对剩下切口的修补 基因基因是具有遗传疚的DNA片段 也是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位 2001 2 12由美 中 日 英 法等国宣布人类基因组草图完成 人类基因组由31 67亿个碱基组成 共有3万个左右基因现代研究表明 基因是一个功能单位 但不是一个不可分割的的最小的重组单位和突变单位 它包含若干个空谈
5、子和重组子 移动基因 movablegene 是指一个或以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置 甚至在不同的染色体之间跃迁 故也称为跳跃基因 但这种移动只是移动一个拷贝 在原来的位置还保留一份拷贝 断裂基因 splitgene interruptedgene 基因编码序列中有与氨基酸编码无关的DNA间隔序列 使一个基因分隔成不连续的若干区段 这种编码序列不连续的间断基因称为 断裂基因的表达程序是 先转录成初级转录物 又叫前体mRNA 然后经过删除和连接 除去无关的DNA间隔序列的转录物 便形成了成熟的mRNA分子 它从细胞核中输送到细胞质 再译成相应有多肽链 其中被剪除的DNA部分叫间隔
6、序列或内含子 intron 被保留下来的DNA部分叫编码序列或外显子 exon 这种内含子的除和外显子的连接 形成成熟的mRNA的过程 称为RNA剪接 假基因 pseudogene 在真核生物中普遍存在 这是一类在基因中稳定存在 核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同 但却不能合成出有功能的蛋白质的失活基因 它是相应的正常基因空谈而丧失活性的结果 人类基因中与蛋白质合成有关的基因只占整个人类基因组的2 重复序列 repeatedsequence 是指在一个DNA分子中出现不止一次的序列 几乎所有的真核生物的基因组DNA中都有重复序列 在人类基因组计划中发现 35 3 的基因组包含重复序列 重
7、叠基因 overlappinggene 是指一个基因的序列中 含有另一个基因的部分或全部序列 即其核苷酸序列是重叠的 基因重叠现象仅发现于一些噬菌和病毒基因组中 中心法则转录翻译DNARNA蛋白质反转录 基因重组目的基因与载体基因 标记基因等的连接叫基因重组重组质粒基因包括 标记片段 启动子 目的基因 终止子 载体基因片段 基因工程的一般操作步骤目的基因的获得载体的选择重组质粒的构建导入目标生物体细胞内转基因重组体的获得转基因生物的鉴定 基因工程的特点生物的基因可以在人类 动物 植物和微生物四大系统间进行交流可以大大缩短育种年限 变异可以定向 基因工程的基本原理和内容一 基本概念 染色体DNA
8、 脱氧核糖核酸 RNA 核糖核酸 基因中心法则 1 DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的 2 DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接 排在外侧 构成基本骨架 碱基排列在内侧 3 两条链上的碱基通过氢键相结合 形成碱基对 它的组成有一定的规律 人类染色体组示意图 细胞核示意图 动物细胞示意图 植物细胞示意图 DNA 脱氧核糖核酸 由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链围绕中心轴的双螺旋结构 两条链中的碱基之间按照A配T G配C的互补原则 以氢键连接 其中A为 腺嘌呤T为 胸腺嘧啶G为 鸟嘌呤C为 胞嘧啶U为 尿嘧啶 RNA DNA直线排列于染色体上 存在于细胞核中 DNA有自我复制的能
9、力 DNA自我复制示意图 DNA双螺旋碱基配对图 RNA 核糖核酸 存在于细胞质中分别有三种功能不同的RNArRNAtRNArRNAmRNA为遗传密码 由DNA转录而来 有关基因的概念 基因是含有一定功能的DNA片段 是遗传的基本单位 获取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆 找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色体上的位置叫基因定位 测定出某段有一定生理功能的DNA片段的碱基序列叫基因测序 按照一定的碱基序列 以核苷酸为原料 合成某段有一定生理功能的DNA片段叫基因合成 基因工程研究的对象 研究生物大分子 如 蛋白质 核酸 多糖等调节生命过程的物质 包括它们的结构 性状 代谢 分子生物
10、学是基因工程的基础 工具酶 三大类 限制性内切酶连接酶修饰酶 Restrictionenzymes recognizespecificshortsequencesofDNAandcleavetheduplex sometimesattargetsite sometimeselsewhere dependingontype 识别序列常是一组含4 6个核苷酸的回文序列 是一类能识别和切割双链DNA分子中的某特定核苷核酸序列的酶RestrictionmapisalineararrayofsitesonDNAcleavedbyvariousrestrictionenzymes DNA限制酶切片段沿染色
11、体或染色体片段的依次排列称作限制图谱 限制性核酸内切酶的命名 按酶的来源的属 种名而定 取属名的第一个字母大写与种名的头两个字母小写组成的三个斜体字母作略语表示 如有株名 再加上一个字母 其后用大写罗马数码 区分同菌株种内具有的不同限制性修饰系统 例如 从流感嗜血杆菌d株 Haemophilusinfluenzaed 中先后分离到3种限制酶 则分别命名为Hind Hind 和HindIII BamH ClaIEcoR HindIII 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 识别DNA的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 是细菌内存在的保护性酶 分
12、为I II III三类 限制性核酸内切酶的分类 II类酶识别序列特点为回文结构 GGATCC CCTAGG 三 限制性内切酶的切割位点 大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征 切断的双链DNA都产生5 磷酸基和3 羟基末端 不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端 钝性末端 bluntend flushend 粘性末端 stickyend cohesiveend 5 端突出粘性末端3 端突出限制性核酸内切酶识别序列长度为4 8个bp 不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端 compatibleend 可用连接酶连接 ABC Restrictio
13、nNucleases RestrictionNucleases 不同有限制性核酸内切酶识别的DNA序列可以不相同 有的识别四核苷酸序列 有的识别六或八核苷酸序列 如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的 则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp 44 出现一次该酶的识别切割位点 同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4096bp 46 或65 536bp 48 出现一次识别切割位点 按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有切点频率 以便选用合适的内切酶 限制性核酸内切酶的种类很多 至今已发现近800多种 可以根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用 从而
14、为基因工程提供了有力的工具 表列出了几种最常用的限制性核酸内切酶的识别序列和切割点 几种最常用的限制性核酸内切酶 同裂酶 isoschizomers 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶位点序列 这类酶称为同裂酶 异源同工酶也用于分析甲基化HpaII和MspI均识别CCGG 其中 表示甲基化 甲基化后HpaII不可切 而MspI可以 同尾酶 isocaudamer 一些来源不同的限制酶 识别的是不同的核苷酸靶位点序列 但是产生相同的粘性末端 这类没酶称为同尾酶 如BamHIGGATCCBclITGATCABglIIAGATCTXhoIIUGATCYU嘌呤Y嘧啶 几个相关概念 限制性内切
15、酶 是一类能识别和切割双链DNA分子中的某特定核苷核酸序列的酶 限制性内切酶的类型及其特征 Figure2 1DNAcanbecleavedbyrestrictionenzymesintofragmentsthatcanbeseparatedbygelelectrophoresis Figure2 2Doubledigestsdefinethecleavagepositionsofoneenzymewithregardtotheother Figure2 3ArestrictionmapcanbeconstructedbyrelatingtheA fragmentsandB fragments
16、throughtheoverlapsseenwithdoubledigestfragments Figure2 5ArestrictionmapisalinearsequenceofsitesseparatedbydefineddistancesonDNA ThemapidentifiesthesitescleavedbyenzymesAandB asdefinedbytheindividualfragmentsproducedbythesingleanddoubledigests Genescanbemappedbyrestrictioncleavage Fourallelesforarestrictionmarkerarefoundinallpossiblepairwisecombinations andsegregateindependentlyateachgeneration PhotographkindlyprovidedbyRayWhite Figure2 6Apointmutationthataffectsarestrictionsiteisdetectedbyadiff
