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1、电生理实验常见问题解答（2）转载wholecell recording的液接电位的补偿问题我们一般都是在电极入水后补偿液接电位。但在下电极的过程中有时基线还在波动，有时还很大。按理说当形成gigacell后，就不能在调节pipeoffset了。但是，当形成巨阻封接后，电极内液和浴液之间的接触就隔断了，然后吸破形成whole cell。这个时候液接电位就消失了。但你入水时已经补了这个液接电位。也就是说形成whole cell后多补了液接电位大小的电压。你记录的电位是实际电位加上液接电位的值。很多人电极内液都是用的葡萄糖酸钾，用axon的液接电位计算公式算的葡萄糖酸钾版的电极内液和外液的液接电位都
2、是10mv以上。这个时候误差就大了。这就产生个问题：这个液接电位怎么补？什么时候补？不补的话你钳制电压应该钳多少，电流钳下记录的膜电位与实际膜电位差多少？请大家说说各自的液接电位补偿的做法和理由。这是一个不错的问题。首先，让我们来看一看offset这个电压是怎么来的。他的来源很广泛，一部分是恒定值，比如放大器的输入offset；一部分是变化值，比如液接电位，它依赖于离子成分；一部分由附加环路产生，包括玻璃电极、试验浴槽或者是氯化银电极；还有一部分是膜片钳放大器产生的。我们调节offset，是把这个电压在放大器里加到command电压上了，从而使得在command电压为零的时候电流也为零。液接电
3、位在入水的时候有，一旦形成巨欧姆封接或者吸破后就不存在了，所以这一部分电位差值有必要考虑进去。我一般的做法是入水之后补offset，一旦开始封接（30M）就不再进行补偿，直至形成巨欧姆封接。在这个过程中，液接电位已经加到command电压里头去了，所以在吸破后测量其膜电位（电流钳）的时候，要将液接电位减去，比如测出来是-50mV，减去液接电位（以+10mV为例），就变成了-60mV。在电压钳模式下的钳制电位也是一样要补上一个液接电位差值的，比如command电压是-60mV，实际输出是-70mV。不知我理解得对不对。关于这个问题，axon的说明书里有比较详尽的补偿方法。我用的灌流槽就中间一个小
4、室，而且体积蛮大的。液体从小室下面进来，到达一定高度后从周围小孔出去。理论上来讲里边的液体应该可以得到充分交换，但不知为何小室内液体的ph要高于流入的和最后流出的acsf。而且液面比较高，控制不好的话脑片会浮起来。不过我设定的流速并不慢，我用的是蠕动泵灌流，流速在4ml/min左右。还有就是温度控制的不稳定，不知你用的那种全浸式灌流槽如何来控制这些问题。因为我觉得这两个问题直接影响了我能否记录到脑片的自发放电。我这两天做了几次，都能记录到自发放电，但持续时间不长，最长的也就2小时左右，短的只有半小时。不知你以前记录的时候一般能维持多少时间，怎样才能使脑片的活性维持较长的时间？我自己没有做过成年
5、鼠的脑片。不过我觉得是先分离海马再冰冻。但是如果没有冻过，脑组织很软，可能不太好分离。我想可能要先将脑组织冻12min在分离比较好些。这样一是组织有些硬度，比较好剥离海马；二是降低组织温度，减少神经元损伤。剥离时最好在冰板上进行，中间要加些4度ascsf保持组织湿润。有人在做成年鼠脑片前是用冰冻的氧饱和的ACSF心脏灌流的。这样可以降低脑组织内部温度，你在剥离海马时神经元的损伤就小一些，从而提高海马神经元的存活率。液面和你的记录槽齐平就可以了，太高会溢出可能漏到显微镜系统里；太低交换不好。脑片可以用白金丝做的U型框粘上尼龙丝来压（陈军的那本书里有介绍怎么做），你也可以将尼龙网粘在白金框，或者银
6、丝也可。你粘尼龙丝时候隔23mm粘一根，这个距离够你下电极了，不会说到做的时候还要调整尼龙网的位置。至于为什么从孵育槽到记录槽要等1h才能记录到自发放电，我也不太清楚。不过我觉得应该要不了那么长时间。是不是你的记录槽液体交换慢了点，适当快点，混合气早点充再试试看。从你现在的情况看，切片估计不是问题了。不知孵育中可能的问题你注意没有：首先还是要给acsf预先给予混合气进行饱和；其次，在孵育时注意在尼龙网下不要形成气泡可能造成脑片底部与液体接触不良；脑片在网上要平摊开，脑片之间最好不要覆盖和折叠。我觉得由于你们这种记录槽液体是从底部流入，可能会造成脑片飘，记录不稳。6mm的高度有些高了，我们的记录
7、槽大约3mm高，太高对显微镜成像效果会有影响。还有，你们的记录槽液体是自下向上流，那么脑片深处得到的氧饱和acsf就好一些，越往上交换过的acsf就多一些。而且你们的槽子这么深，积累的废液也相对多些。或者这么说，同样的流速，6mm深的记录槽液体和气体交换的时间要长于3mm的记录槽，这可能会影响到脑片在记录槽中的活性。而你要是加快流速的话，又会加剧脑片的飘荡，影响记录的稳定。所以，我觉得你的记录槽需要改进。要不降低高度试试，要不用我上次说的那个记录槽。不过用我说的记录槽，你的加温系统不知能不能上上去。应该每个海马的锥体神经元都可以记录到0.1 mM glutamine 诱导的电流的，不知你是想记
8、*AR介导的电流，还是AMPAR/KA介导的电流，如果是前者，应该用无Mg2+溶液和13 微摩尔的gly才可以记录到。另外，你配好的glutamine溶液要注意pH的变化，可能会偏酸，而H+对glutamine电流是抑制的。model cell实际就是模拟patch记录的三个阶段: 1、电极入水。电路上就是一个10M的电阻；2、巨阻形成。电路上是1个10GM的电阻；3、whole cell形成。电路是一个500M的电阻和一个电容构成的回路。三种状况均可在seal test窗口中看到。seal test和你给step 刺激一样，都是在model cell上加个电压，窗口显示了记到的电流大小。同理
9、你也可以在电压钳下给step，利用欧姆定律自己根据给的电压和记到的电流算电阻。这个值可能不会那么标准就等于三种状态下的电阻，这与仪器自身的噪声及性能有关，但不会有太大的偏差。如果偏差很大，比如应该为10M只记到5M，可能里面有问题。这时你就要排除是model cell的问题还是放大器的问题。测model cel电阻排除一下model cell的问题。如果model cell没问题，对照说明书用它校正一下放大器。最大的可能就是封接系统漏气。将电极固定在holder上，电极尖端烧闭。三通管与带电极的holder整体浸入水中，从三通管给气体，看三通管、三通管与软管连接处、软管与holder连接处等易
10、于漏气的地方是否有气泡冒出。如有，用胶将其封闭，或者换新管。还有一种可能就是电极堵了，不过电极堵的话电极电阻会有较大的增加，很好辨认。电极内液是在入水之前灌充的，一旦钳制以后，可能就不能更换了，因为一旦更换，就不可避免引起振动，这是膜片钳实验的禁忌之一，很容易引起细胞的死亡。另外，关于渗透时间的问题，我曾经特意作过time-course，通常电极内液完全渗透到细胞内，使电极内和细胞内达到平衡大约在5min左右，有时候因为负压大小或其他的原因，可能大于或小于5min，虽然没有作过氨基酸，但是时间也是差不多的。1、如果你考虑与鼠龄有关，建议你查查有关大鼠发育的文献，看看你所做核团是在生后多少天发育
11、成熟。也可以参考做该核团的文献，看看别人用多大的老鼠。（我个人认为觉得20d应该没有问题）2、渗透压不知是你计算的还是实际测量的。有人提出渗透压略高一些还有利于细胞的长时间存活，甚至有人孵育时用高渗的蔗糖脑脊液，记录时用正常脑脊液。你可以参考别人的文献，适当调整一下方子。这个要靠你自己摸索，各个实验室不一样。3、孵育时氧饱和越充分越好。我们一般都事先给孵育槽里充氧2h左右。因为混合气里co2比例一定，而且需要它稳定acsf的ph值，这和在体不一样，应该不存在通气过量的问题。这种银丝是直接装在holder里的，axon放大器原配的holder配了两个密封圈，用以密封holder内气路。需要注意的
12、是，你要看看与前置放大器相连的一端的那个密封圈是否与holder的边缘齐平，这是保证接触良好的前提。银丝是可以直接从这一头取出来，镀好了再放进去的。注意插进去之后要在银丝的末端打个弯，这样银丝就可以扣在密封圈上，并和用来插入前置放大器的金属紧密接触。不需要焊，否则密闭性能就会下降。1、如果外液中存在细菌的话，一方面可能影响封接成功率，另一方面，细菌可能会分泌一些毒素，从而影响细胞活性。2、对于玻璃电极来说，影响封接成功率的主要有两个因素，一个是电极尖端口径，这主要表现在电极阻抗上，一般说来，达到3-6兆的都可以，但如果细胞比较小的话，那么阻抗要高些（这样口径小些）才更有利于封接。另一个因素就是
13、电极的形状，使用两步拉制仪的优点即在于此（其实，最好的是水平拉制仪，可以根据需要进行多步拉制，得到各种需要的形状）。细胞一吸就破是因为消化的太过了，可以试试减少酶量和缩短消化时间。活性好的细胞镜下看起来很光滑，形态规整，核隐约可以看见，颜色蓝蓝的做完一个细胞后当然要换电极，因为此电极已被污染啦。分析曲线可以找资料看看嘛。细胞内记录最重要的是要将玻璃微电极尖端插入细胞内，并且能够不把细胞弄破，能够维持较长一段时间。要做到这一点，关键在于能拉制出合格的玻璃微电极，根据我们的经验，在海马脑片上要进细胞的话电极在冲灌3MKCl后阻抗应该不低于60兆欧，这是因为海马中的细胞决大多数为体积较大的锥体细胞，
14、容易进入。而在如纹状体等核团中，大多数细胞是体积较小的中间神经元，只有尖端直径较小的玻璃微电极才能进入，阻抗应不小于120兆欧。在微电极进细胞的一瞬间会在计算机屏幕上观测到基线的明显的突然降低，这时需要立即通过放大器向细胞内注入超极化电流使细胞内发生超极化，并维持一段时间使细胞稳定不至于因损伤而大量放电死亡。随后再将超极化电流逐渐减小至零，这时在放大器上显示的膜电位才是细胞真正的静息膜电位。需要注意的是为了使玻璃微电极尖端的分布电容减小到最低程度，在拉制冲灌好后最好将电极尖端表面涂上生物油以绝缘。如果电流overload，第一件要做的事情就是把银丝电极芯氯化一下，很多时候都是它引起的。此外你的
15、接地的导线如果不该弄湿的地方弄湿了也会出现过载的情况。我们现在配acsf的试剂都是用的国产的分析纯。我觉得这个不是最关键的，但是个要保证的基本问题。也就是说，你拿试剂时最好买近两年的，这就可以保证脑片活性了。我觉得还是切片和孵育要掌握好。再就是你可以查查是否有人做过和你类似的文章，直接email和作者联系。我们那个灌流槽使用时没有什么太多注意的。灌流时保持液面和槽的高度平齐就可；加温就要靠你自己解决；使用时可以在两个缓冲室里放两团棉花，减少液面波动。实验后注意清洗，尤其是联系记录槽和缓冲室的小管。我们一般配好acsf后就开始预通气，气量一般出气管出来成串就可，不用太大。分装的灌流和孵育的都要给
16、。分氧压表上1小格左右。灌流液温度最好能保持恒定，波动不要太大。不知道是否能够封接上？如果最终封接不好，达不到封接，估计是电极前端沾有污染物，入水后因为污染物，使得电阻抗比较大，给正压后，使得污染物对电极尖端的的阻挡减少，所以阻抗降低接触后阻抗当然会增加了不知道是不是近几天的试验都是这样？因为具体的情况我不完全了解，如果是的话，那我还是坚持我的观点，是因为有污染物的问题，如果没有处在电极尖端中央，没有将电极尖完全堵住的情况下，也是可能出现像你叙述的情况的，即使是封接上了也是暂时的，不牢固的，我也遇到过这样的情况。妨碍封接的污染物可能来自以下几个方面：1.灌流液中的杂质2.电极内液中的杂质3.细胞分离的不是很理想，状态不好，消化过了或是不足都可能导致细胞表面附有许多杂质颗粒，从而影响封接。1、记录室与进液室、记录室与出液室之间的两个直径
