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1、 基因组DNA提取与PCR技术 李兆阳 前言 在基因工程和蛋白质工程中 核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象 所以核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术 核酸样品的质量将直接关系到实验的成败 主要内容 基因组DNA提取1 核酸的分类及理化性质2 几种核酸提取方法的基本原理及实例分析3 常见问题与对策 核酸分为两大类 脱氧核糖核酸 DNA DeoxyribonucleicAcid核糖核酸 RNA RibonucleicAcid 脱氧核糖核酸 DNA DNA分子含有生物物种的所有遗传信息 分子量一般都很大DNA结构 核糖核酸 RNA RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达 分子量
2、要比DNA小得多 RNA为单链分子 核酸的理化性质 RNA核苷酸的纯品呈白色粉末或结晶 DNA则为白色类似石棉样的纤维状物 除肌苷酸 鸟苷酸具有鲜味外 核酸和核苷酸大都呈酸味 DNA RNA和核苷酸都是极性化合物 一般都溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 它们的钠盐比游离酸易溶于水 RNA钠盐在水中溶解度可达40g L DNA在水中为10g L 呈黏性胶体溶液 在酸性溶液中 DNA RNA易水解 在中性或弱碱性溶液中较稳定 核酸的理化性质 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白 DNP 形式存在于细胞核中 要从细胞中提取DNA时 先把DNP抽提出来 再把P除去 再除去细胞中的糖 RNA及无机离子等
3、 从中分离DNA 核酸的理化性质 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同 DNP在低浓度盐溶液中 几乎不溶解 如在0 14mol L的氯化钠溶解度最低 仅为在水中溶解度的1 随着盐浓度的增加溶解度也增加 至1mol L氯化钠中的溶解度很大 比纯水高2倍 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小 在0 14mol L氯化钠中溶解度较大 因此 在提取时 常用此法分离这两种核蛋白 DNA提取的几种方法 1 浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同 将二者分离 常用的方法是用1M氯化钠提取液抽提 得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡 使乳化 再离心除去蛋白质 此时蛋白质
4、凝胶停留在水相及氯仿相中间 而DNA位于上层水相中 用2倍体积无水乙醇可将DNA钠盐沉淀出来 也可用0 15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP 再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白 再按氯仿 异戊醇法除去蛋白 两种方法比较 后种方法使核酸降解可能少一些 2 阴离子去污剂法 SDS是一种阴离子去垢剂 在高温 55 65 条件下能裂解细胞 使染色体离析 蛋白变性 释放出核酸 基因组DNA SDS法 以动物组织为例 3 苯酚氯仿抽提法 苯酚作为蛋白变性剂 同时抑制了DNase的降解作用 用苯酚处理匀浆液时 由于蛋白与DNA联结键已断 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶 蛋白分子溶于酚相
5、而DNA溶于水相 离心分层后取出水层 利用核酸不溶于醇的性质 用乙醇沉淀DNA 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 4 水抽提法 利用核酸溶解于水的性质 将组织细胞破碎后 用低盐溶液除去RNA 然后将沉淀溶于水中 使DNA充分溶解于水中 离心后收集上清液 在上清中加入固体氯化钠调节至2 6M 加入2倍体积无水乙醇 立即用搅拌法搅出 然后分别用70 80 和95 乙醇洗涤 最后在空气中干燥 既得DNA样品 几种方法的比较苯酚 氯仿抽提 醇沉淀方法 是一个永不过时的方法 稳定 可靠 经济 方便 苯酚 氯仿抽提可以彻底去除蛋白质 醇沉淀可以去除盐 对于一般的干净的样品 杂质为蛋白质 该方法完全可
6、以获得高质量的核酸 关键 酚氯仿要混匀彻底 用量足够 浓盐法 高盐沉淀蛋白质 醇沉淀方法 同样也是一个非常不错的方法 与酚氯仿抽提方法相比 纯度的稳定性可能要低一点 更快 更轻松去除蛋白质所伴随的好处是 可以用于大规模抽提 不足是纯度 蛋白质残留 不够稳定 水沉淀 此法提取的DNA中蛋白质含量较高 故一般不用 实例分析 从鼠尾组织中提取基因组DNA 弃上清 12000rpm10min 12000rpm10min 12000rpm10min 4度保存 PK SSTE55度 流程图 DNA中含有蛋白 多糖 酚类杂质DNA在溶解前 有酒精残留 酒精抑制后续酶切和PCR反应DNA中残留有金属离子 重新
7、纯化DNA 去除蛋白 多糖 多酚等杂质重新沉淀DNA 让酒精充分挥发后再溶解 增加70 乙醇洗涤的次数 2 3次 DNA提取常见问题 问题一 DNA样品不纯 抑制后续酶切和PCR反应 原因 对策 材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈 DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融 尽量取新鲜材料 低温保存材料避免反复冻融在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时 可增加裂解液中螯合剂的含量操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制 耗材经高温灭菌将DNA分装保存于TE缓冲液中 避免反复冻融 DNA提取常见问题 问题二 DNA降解 对策 原因 实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不
8、完全洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜 幼嫩 的材料 适当增加用量 高温裂解时 时间适当延长 适当增加PK的用量 低温沉淀 延长沉淀时间注意动作轻柔 避免丢失 DNA提取常见问题 问题三 DNA提取量少 对策 原因 DNA电泳图 PCR技术 1 PCR发展历史2 PCR原理及引物设计基本原则3 常见问题与注意事项4 PCR技术的发展 PCR发展历史 PCR的设想本世纪60年代末 70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想 经过DNA变性 与合适的引物杂交 用DNA聚合酶延伸引物 并不断重复该过程便可克隆目的片段 PCR的实现1985年美国PE C
9、etus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应 其原理类似于DNA的体内复制 只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件 模板DNA 引物 DNA聚合酶 合适的缓冲体系 DNA变性 复性及延伸的温度与时间 一 PCR的基本原理 DNA的复制 replication 由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程 基本原理 在模板 引物 4种dNTP和TaqDNA聚合酶存在的条件下 特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应 基本步骤 变性 加热使双链DNA变为单链退火 降温使引物和互补模板在局部形成杂交链延伸 耐热DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物
10、为起始点的延伸反应 一 PCR的基本原理示意图 Flash演示 二 PCR引物设计PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计 引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性 其效率和特异性取决于两个方面 一是引物与模板的特异结合 二是聚合酶对引物的有效延伸 1 引物长度一般为15 30个核苷酸 2 引物中的碱基尽可能随机分布 避免出现嘌呤 嘧啶的堆积现象 尤其是引物的3 端不应有连续3个G和C 否则会使引物在模板的G C富集序列区错误配对 引物中G C的含量在45 55 左右 设计引物时要考虑3 端和5 端引物具有相似的Tm值 Tm 4 G C 2 A T 引物长度要确保解链温度不低于54
11、 C3 引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构 4 两个引物之间不应存在互补序列 尤其应避免3 端的互补重叠 一 PCR引物设计原则 5 引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性 尤其是引物3 末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列 否则易导致非特异性扩增 6 引物3 端碱基是引发延伸的起点 因此一定要与模板DNA配对 引物3 端的最佳碱基选择是G和C 因为它们形成的碱基配对比较稳定 7 引物的5 端可以修饰 如附加限制酶位点 引入突变位点 用生物素 荧光物质 地高辛标记 加入其它短序列包括起始密码子 终止密码子等 在PCR的起始反应中 引物5 端游离的碱基并不影响引导新生链
12、DNA合成的能力 但在后续的扩增循环中 这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去 所以这种引物参与的PCR反应产物 既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列 二 引物设计的方法 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行 可以直接提交模板序列到特定网页 在线引物设计的网站有 http cbr rbc nrc cnrc ca cgi bin primer3 www cgi www cgi http genome www2 stanford edu cgi bin SGD web primer http bioinformatics weizmann ac il cgi bin pr
13、imer primer3 cgi http itsa ucsf edu urolab methprimer index1 html http alces med umn edu rawprimer html 10 扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol L引物10 100pmol模板DNA0 1 2ugTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol L加双或三蒸水至100ul 标准的PCR反应体系 PCR反应条件的控制 PCR反应成分1 PCR反应的缓冲液 10 50mmol LTris Cl缓冲液 72 时pH7 2 调节反应体系的pH值 使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏
14、碱性 缓冲液含50mmol L的KCl可促进引物退火 大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性 加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构 TaqDNA聚合酶活性需要Mg2 Mg2 浓度过低 会显著降低酶活性 Mg2 浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强 Mg2 浓度还会影响引物的退火 模板与PCR产物的解链温度 从而影响扩增片段的产率 在PCR反应中 Mg2 的总量应比dNTPs的浓度高 其原因是引物 模板 dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2 结合而降低游离Mg2 浓度 从而影响TaqDNA聚合酶的活性 常用1 5mmol L 2 镁离子浓度 1 5mmol L dNTP溶液具有较强
15、的酸性 使用时应用NaOH将pH值调至7 0 7 5 分装小管 于 20 存放 过多冻融会使dNTP产生降解 在PCR反应中 dNTPs浓度在20 200 mol L dNTP浓度过高可加快反应速度 同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本 反之 低浓度的dNTP会导致反应速度的下降 但可提高反应的特异性及实验的精确性 4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制 以减少错配误差和提高使用效率 3 底物浓度 20 200 mol L 在PCR反应中 DNA聚合酶是最关键的因素之一 PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段 T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶 它们因对热的稳定性差而未得到
16、广泛应用 直到耐热的DNA聚合酶 TaqDNApolymerase 应用于PCR反应 才使这一技术得到迅速发展和广泛应用 4 耐热DNA聚合酶 2 5 5u TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在75 80 具有最高的聚合酶活性 75 80 每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸 70 时延伸速度在60个核苷酸 秒以上 55 时为22个核苷酸 秒 37 和22 时分别为1 5个和0 25个核苷酸 秒 温度超过80 时 合成速度明显下降 可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关 TaqDNA聚合酶没有3 5 外切酶活性 没有校正功能 对于30次循环的PCR扩增反应 此酶的错配率为0 1 0 25 TaqDNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的 因此在特别考虑扩增产物忠实性 推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶 如Vent和PfuDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能 能催化dNTP加到DNA的3 OH端 但对4种dNTP聚合到3 未端的能力不同 对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸 因此PCR产物的末端总是带有两个A 我们利用它的这
