《质粒的保存实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒的保存实验（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、质粒的保存实验一、实验基本流程：制备大肠杆菌感受态细胞质粒转化感受态细胞转化子的鉴定与筛选重组子的菌种保藏二、材料与方法1、材料1.1 培养基的配置（1）LB培养基：0.5%酵母抽提物；1%蛋白胨；1%NaCl；pH 7.0-7.5(固体培养基加入2%琼脂粉)（2）LB Amp平板：LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为100ug/mL,摇匀后铺板。（3）LB Kan平板：LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右,加入Kan储存液,使终浓度为50ug/mL,摇匀后铺板。1.2 缓冲液的配置（1）电泳缓冲液（每升）：5TBE：Tris base 54g；硼酸27.5g
2、；0.5M EDTA（pH 8.0）1.3 药品的配置（1）50%甘油：50mL甘油用重蒸水定容至100mL,高压灭菌。（2）75mM CaCl2：称取1.1g CaCl2.2H2O(分析纯),溶于50mL重蒸水中,定容至100mL,高压灭菌。（3）75mM CaCl2（15%甘油）：称取1.1 g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。（4）100mg/mL Amp母液：称取Amp粉末1g，用10mL灭过菌的重蒸水溶解定容后，分装，于-20保存即可。（5）50mg/mL Kan母液：称取Amp粉末0.5g，用10mL灭过菌的重蒸水溶解
3、定容后，分装，于-20保存即可。2、方法2.1 DH5大肠杆菌感受态细胞的制备 接30uL DH5甘油菌于3mL LB中，37，250rpm，培养过夜 接3mL LB培养的DH5大肠杆菌500L于100mL LB培养基中，37，250rpm，1h（左右，云雾状，OD600=0.3-0.4） 分装3个50 mL离心管，冰浴10min 4,4000 rpm,7min离心后，弃上清 三管沉淀合于一管，加入30 mL（大概量）冰预冷75mM CaCl2，重悬沉淀，冰浴30min 4,4000 rpm,5min离心后，弃上清（沉淀要呈条带状） 加入3-6mL冰预冷75mM（含15%甘油）CaCl2，重悬
4、沉淀 分装，每个ep管加200L菌悬液 冰上放置2-4h，-20冰浴，再放入-80冰箱保存2.2质粒的转化 取0.5uL质粒加入到制备好的200L感受态细胞中 混匀，冰浴30min 37热休克5-7min 冰浴3min 加800L LB培养基，混匀，37温育45-60min 4000rpm离心5min，去部分上清，菌体重悬，涂布含Amp/Kan的LB平板，37倒置培养过夜。2.3 重组质粒的提取用Biospin质粒DNA小量提取试剂盒抽提，具体方法见产品说明书2.4 重组质粒的电泳鉴定跑1.0%琼脂糖电泳鉴定即可。2.5 菌种的保存 将验证正确的菌种用灭过菌的牙签或枪头挑到3mL（含100ug/mL Amp或50ug/mL Kan）中37，250rpm，培养过夜。 取700L菌液和300L 50%甘油混匀，于-80冰箱保存。每个质粒各保存十株，每株各保十管。
