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1、实验八 全自动顶空气相色谱法建立木材指纹图谱第一部分：实验原理 1 顶空分析技术原理 顶空技术主要用于分析固体或液体顶部蒸汽相中的有机挥发性物质，而气相色谱适用于分析挥发性和半挥发性的化合物，所以顶空技术是一种非常适合与气相色谱进行联用的分析方法。我系化学实验教学中心拥有一套完整的带有瑞士CTC公司combipal型带顶空装置的三合一自动进样器装置的Varian 3900气相色谱仪。 顶空分析技术就是气体萃取技术，常常用于气相色谱分析。对于样品中衡量高挥发性物质的分析测定，可以使用气体萃取的方法，因为气体是挥发性物质最理想的溶剂。顶空分析法通常可分为三类：静态顶空分析; 动态顶空分析和顶空-
2、固相微萃取。他们具有以下特点：操作简单；可以自动化；可变因素多；灵敏度高。 静态顶空分析是在一个密闭的容器中，其中的样品与样品上方气体达到平衡，直接抽取样品上方气体进行分析测试的技术，常被认为“一步气体萃取” 。静态顶空顶空分析原理的示意图见图1。图1 静态顶空分析法原理示意图 静态顶空分析法在仪器模式上可以分为三类：顶空气体直接进样模式、平衡加压采样模式和加压定容采样进样模式。本实验采用的是顶空气体直接进样模式，故重点讨论这种模式。顶空气体直接进样系统配有气密性的气体取样针,一般在气体取样针的外部套有温度控制装置。静态顶空分析气体直接进样可以分为两步：首先，将液体样品或者固体样品放在一个密闭
3、的玻璃样品瓶中，并保持样品瓶中的样品上方留有一半以上的气体空间，在一恒定的温度下使两相达到平衡；然后，使用气密性注射器等份抽取样品瓶中的顶空气体直接注入到色谱仪注入口中进行色谱分离和测定。这种静态顶空分析法模式具有适用性广和易于清洗的特点,适合于香精香料、苯系物、香水、烟草和香樟树等挥发性样品含量较大的样品。静态顶空分析法的主要缺点是有时必须进行大体积的气体进样,这样挥发性物质的色谱峰的初始展宽较大会影响色谱的分离效能；另外进行定量测定也比较繁杂，必须考虑样品基体的干扰。 化学实验教学中心全自动顶空-气相色谱分析系统由全自动顶空气体采集器气相色谱仪和火焰离子化检测器组成。在顶空分析技术中，萃取
4、过程可以分为两个步骤：第一，被分析组分从液相中先扩散穿透到气相中；第二，被分析组分从气相转移到萃取固定相中。这种改型可以避免萃取固定相受到某些样品基质中高分子物质和不挥发性物质的污染。在该萃取过程中，步骤二的萃取速度总体上远远大于步骤一的扩散速度，所以步骤一成为萃取的控制步骤。因此挥发性组分比半挥发性组分有着快得多的萃取速度。实际上对于挥发性组分而言，在相同的样品混匀条件下，顶空萃取的平衡时间远远小于直接萃取平衡时间。为了能够得到良好的重现性和有效的色谱分离,必须对样品的制备、温度和平衡时间、衍生化法、顶空气体的采集和传输等有关参数进行考察。 顶空-气相色谱分析的应用实例： (1)生物样本中挥
5、发性有机物的测定，如香樟树色谱指纹图谱的建立； (2)药品中有机溶剂残留的测定； (3)有机聚合材料中挥发性有机物的分析，如苯系物的分离测定； (4)环境分析； (5)挥发油分析；(6)烟草行业的应用2 指纹图谱含义指纹图谱是指将研究对象经过适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的共有峰的色谱图或者光谱图等。形象地讲，木材指纹图谱就是木材的身份证，该木材的主要化学信息都能体现在指纹图谱上，指纹图谱使木材一材一图，决不混淆。指纹图谱具有模糊性和整体性等特点。从分子水平研究木材的化学成分，进而建立木材的指纹图谱具有重要的理论意义和实际需要。建立好木材的指纹图谱，就可以进行木材识别
6、。要把识别技术建立在研究清楚每个内含成分的基础上，很不现实。这就要求，在尚不清楚全体化学成分的情况下，实现对物质群整体的控制。而现代色谱、光谱、波谱、质谱等仪器分析所得物质群指纹图谱，展现了这种可能性。几个物质群在相同仪器、相同试验条件、相同操作方法下所得的指纹图谱相同性，即可反映这些物质群的同属性。虽然对图谱中每个特定峰的成分并不了解，也即对物质群的化学成分并不全知晓，但这并不影响对物质群一致性的判断。以香樟木为例，设定以下实验条件：进样口温度为230； 进样体积为400 L；进样针温度为100 ；振荡器温度为80 ；振荡器加热时间为10min；检测器温度为260 。柱温升温程序：起始温度6
7、0，保持0.5分钟后以每分钟20的升温速率升至100 ，保持3分钟后以每分钟6的升温速率升至180 ，保持0.5分钟后以每分钟10的升温速率升至200 。在以上实验条件下，得到其色谱总离子流图谱如图2所示。 图2 香樟色谱指纹图谱3 模式识别与主成分分析原理 用不同的木材标准样品按照优化后的色谱条件进行实验后，在计算机系统里保存各木材标准样品的色谱指纹图谱数据。用同样的色谱方法对待检验木材样本进行检测，然后将获得的色谱图数据与标准库进行对比，就可以判定待检验样本属于哪类木材样本，从而实现模式识别。模式识别是指对表征事物或现象的各种形式的(数值的、文字的和逻辑关系的)信息进行处理和分析,以对事物
8、或现象进行描述、辨认、分类和解释的过程,是信息科学和人工智能的重要组成部分。模式识别方法很多。在本实验中，主要采用统计模式识别。统计模式识别的基本原理是：有相似性的样本在模式空间中互相接近，并形成“集团”，即“物以类聚”。其分析方法是根据模式所测得的特征向量Xi=(xi1,xi2,xid)T(i=1,2,N)，将一个给定的模式归入C个类1,2,c中，然后根据模式之间的距离函数来判别分类。其中，T表示转置；N为样本点数；d为样本特征数。统计模式识别的主要方法有：判别函数法，k近邻分类法，非线性映射法，特征分析法，主成分分析法等。本实验主要采用主成分分析法来对木材进行模式识别。 简要介绍一下主成分
9、分析方法。分析手段的仪器化和化学体系的复杂化已成为现代分析化学学科的两大重要特征。与其同时，化学计量学也迅速发展起来。从现代化学计量学的观点看，仪器分析数据的传统处理方法“如对光谱、波谱只取其峰值，对色谱只计算其面积等，这样做的后果只能造成大量有用信息的浪费。面对形形色色的多组份体系，在充分利用化学量测仪器所产生的化学信号特点的基础上，化学计量学运用统计学和应用数学及计算机，最大限度地从中抽取不同特性样本中的定性、定量化学信息。色谱联用技术的实验结果常用多种指标来表征，如果希望综合使用这些指标，就可以通过主成分分析方法把数据的维数降低。主成分分析在尽量不损失数据中的信息的前提下进行，其目的是从
10、原始的多个变量取若干变量进行线性组合，以尽可能多地保留原始变量中的信息，新变量互不相关即正交。本实验中，对所获得的待检验样本色谱图数据进行主成分分析，然后进行主成分分析投影，根据物以类聚的原则，相似的物质聚集在相邻的区域。如果将数据库中标准样品和待检验样品的色谱数据综合处理，则可以将待检验样本与标准样品进行聚类分析，从而实现待检验木材样品的模式识别。 聚类分析是一种分类学与多元分析相结合的多元统计方法，它将分类对象置于一个多维空间中，按照空间关系的亲疏程度进行分类，即根据事物彼此不同的属性进行辨认，将具有相似属性的事物聚为一类，使同一类的事物具有高度的相似性。本质上，聚类分析是按“物以类聚”的
11、原则将特性相近的变量或观察单位进行分类。聚类分析是一种探索性的分析。聚类分析可以分为层次聚类分析和快速聚类分析。层次聚类分析中根据聚类的对象不同分成Q型聚类和R型聚类。Q型聚类是针对样本进行聚类，它使具有相似特性的样本聚集在一起，使差异性大的样本分离开来；R型聚类是对变量进行聚类，它使具有相似性的变量聚集在一起，差异性大的变量分离开来，实现减少变量个数。快速聚类分析主要用于样本量过多或异常庞大的情况。在本实验中，利用excell的相关功能对获得的各待检验样本色谱图数据进行对齐各样本的保留时间等预处理，然后计算各待检验样本色谱图峰面积与标准样品峰面积之间的相关系数。相关系数越高，说明两种物质化学
12、性质越相似，类别越相近；反之，则表明类别关系越远。4 数据处理 首先要结合线性代数知识，理解所获得色谱图的数据构成和所代表的化学意义。 简要介绍用Metlab编程语言如何进行主成分分析法投影分类。实施该算法的具体步骤是，将待检验样品量测所得数据矩阵（设为Y）进行一定的预处理，然后导入Metlab工作环境中，输入命令U，S，V=svd(Y) 进行奇异值分解，取U矩阵中的前两列矢量分别作为第一主成份（横轴）和第二主成分（纵轴），作二维平面图，即可以直观地观察到各个待检验样本所处空间。图3为两种不同木材作了共5个批次的实验后运用主成分分析法投影后进行模式识别的结果。其中一种是两个香樟样本，为图中标号
13、4，5处；另外一种是三个松树样本，为图中标号1，2，3处。由图可知，分类效果明显。 图4 PCA投影用于树皮模式识别结果第二部分 实验操作一. 实验目的1、熟悉HS-GC-FID联用仪器的操作方法和实际样品分析方法的建立过程。2、了解指纹图谱概念，学习快速建立各类木材指纹图谱的过程。3、了解主成分分析原理与投影、模式识别与Excel中相关系数的计算方法。4、 学习化学计量学数据处理基础知识。5、 学习自主设计实验二. 仪器与试剂1、仪器 Varian 3900气相色谱仪，瑞士CTC公司Combipal型带顶空装置的三合一自动进样器。2、实验样品 木材类：香樟、松树、银杏、梧桐等四种树或其树皮。
14、 三. 实验原理与技术 顶空气相色谱分析方法是通过测定样品上方气体成分来测定该组分在样品中的含量，其理论依据是在一定条件下气相和液相（固相）之间存在着分配平衡。本实验体系中，各种木材所含的挥发性化学物质在性质和含量上都有差异。当进行顶空气相色谱分析时，表现为各种木材树皮都具有自己特征的色谱流出曲线。利用这种色谱流出曲线的特征性，经过适当的数据处理，就可以将同一分析方法下获得的各种木材的色谱特征图与标准库里谱图相匹配，根据不同的匹配度对不同木材进行模式识别。本实验采用静态顶空气相色谱法，建立指纹图谱库所需的木材标准品来源于上海华东木材研究所，待检验样品为实验人员自带。四. 实验内容1、色谱条件
15、(1)色谱柱：Varian HPINNOWAX（30m0.25mm0.25um，固定相：键合/交联聚乙醇，极性柱） (2) 柱温采用程序升温，升温程序见下表：temprateholdtotal600.50.580100.5313031.521.17200180.525.56(3) 检测器温度： 260 (4) 进样口温度： 230 (5) 分流比：5：12、顶空装置的参数设置(1) 进样体积：400 L (2) 进样针温度：110 (3) 振荡器温度：100 (4) 加热时间：10min(5) GC循环时间：21min3、实验步骤 (1) 采集香樟、松树、银杏、梧桐等四种树的树皮样品各0.5克装入顶空瓶。 (2) 开启HS-GC-FID等实验相关设备 (3) 根据前期实验得到的优化结果设定实验色谱条件 (4) 运行方法，分别测定各样品，各进样六针并采集各自的色谱数据，根据获得谱图数据进行数据处理。5. 数据处理下面的是经过处理的数据（不包含时间）：珊瑚树1珊瑚树2珊瑚树3 204019612187173525311730
