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1、第一章 绪论1.基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 2.基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3.基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 （2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 （3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 （4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）
2、。 （5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 4.基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。 2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。 （3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物； 用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。（4）基因工程
3、在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。（5）基因工程商业化的发展第二章 基因工程主要技术原理1质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。步骤：1）溶菌：溶液I（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA,4-5mg/ml 溶菌酶） 2）
4、破膜：溶液II（0.2N NaOH 1.0%SDS） 3）中和：溶液III（3M醋酸钠 pH4.8） 4）离心 5）转移：将上清转移到一个新的离心管中 6）抽提：酚-氯仿抽提，酚/氯仿/异戊醇25/24/1 7）沉淀：用0.6倍体积的异戊醇或2倍体积的乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸铵辅助沉淀）基因组DNA的提取纯化方法（1） 细菌基因组DNA的制备细胞裂解（10%SDS和蛋白酶K。SDS是阴离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。）DNA纯化（CTAB(十六烷基三甲基溴化铵) 除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。）沉淀DNA（0.6倍体积的异丙醇或2倍乙醇（可以加入1/10
5、体积的3M醋酸氨辅助沉淀）（2） 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提组织粉碎（动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末；组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。）细胞裂解（0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50温育。）沉淀DNA（用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇。（加入1/10体积的3M醋酸氨可以辅助沉淀）。）（3） 从植物组织中制备 DNA组织粉碎（用液氮冷冻后研磨成细粉末。）细胞裂解（用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）或1% SDS和蛋白酶K。 65 温育。）沉淀DNA（用0.6倍体积的异丙醇（-20）。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉
6、淀）2.DNA的定量和纯度测定方法（1）紫外光谱法： DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，蛋白质在280nm波长处有特异的紫外吸收峰 ，对于纯DNA： OD260/OD280 =1.8，若低于1.8说明有蛋白质杂质（2）琼脂糖凝胶电泳估计溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。3.琼脂糖凝胶电泳基本原理及应用原理：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等
7、）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。相同分子量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开放开环状最慢。琼脂糖凝胶电泳的应用：用于对DNA分子量的估计，DNA片段的分离和回收。4.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide)和交联剂N1，N1-甲叉双丙烯酰胺(N1，N1- methylene bisacrylamide)在催化剂的作用下聚合而成。引发剂：过硫酸铵，加速剂：TEMED。电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大
8、分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。凝胶浓度越大，空隙越小。电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片。5.核酸杂交原理、类型及应用原理：核酸分子杂交技术是依据核酸分子碱基互补、变性和复性原理，用标记的已知序列的单链核酸片段(DNA或RNA)作为探针,与未知的核酸片段进行杂交, 形成异源性杂交分子，然后通过标记信号的检测，鉴定样本中是否存在与探针互补的靶序列DNA。包括：DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。特点：特异性高；灵敏度高；定位准确应用：基因克隆的筛选；酶切图谱制作；基因组中特定基因序列的定量和定性检测； 基因表达的分析；基因突变分析；疾病的诊断、微生
9、物病原体检测。变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。Tm=（G+C）%0.41+69.3Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这
10、样的复性又称为退火。预杂交：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交类型：根据核酸的来源、种类和形式分为Southern blot，Northern blot，菌落原位杂交，斑点杂交，组织原位杂交Southern blot：DNA分子限制性酶切为限制片段琼脂糖凝胶电泳NaOH变性转膜固定杂交显影Northern blot：提取 T、Cell 总 RNA提纯分离mRNA琼脂糖凝胶电泳分离RNA转移至硝酸纤维素膜杂交检测斑点杂交：其原理与步骤与Southern印迹杂交相似，所不同的是不进行核酸的酶解和电泳分离，直接将变
11、性的DNA或RNA加到固相载体上。菌落/噬菌斑原位杂交：直接将菌落(噬菌斑)原位转移到固相载体上，不必进行核酸的分离纯化、酶解和电泳分离。溶菌(噬菌斑)变性后直接进行特异核酸（DNA或RNA）分子的杂交技术，结果直接找出相应的阳性重组子菌落(噬菌斑) 。组织/细胞原位杂交：用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞、组织、染色体或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。 基因芯片：基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。 6.PCR概念
12、、PCR技术的基本原理及特点、引物设计要求及常见问题PCR概念：应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。PCR技术的基本原理：类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开。退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合。延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循
13、环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍。 经过多次循环使DNA含量显著提高。特点：灵敏度高、特异性强、快速检测、定量准确、重复性好特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。引物设计要求： 引物长度（length）: 2030bp G+C含量以40-60%为宜 两引物间不能有互补序列，尤其是3端 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性 引物的3末端碱基一定要与模板DNA配对 可以在5末端加上限制性内切酶位点或起始密码 解链温度(Tm)：两引物
14、间相差不大于5 引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列常见问题：（1） 假阴性原因：模板质量不好；酶失活；引物特异性差或质量问题；Mg2+浓度过高 对策：重新准备模板；更换酶并避免反复冻融；重新设计引物并分装；降低Mg2+浓度（2） 假阳性原因：引物设计不合适 ；靶序列或扩增产物的交叉污染 对策：重新设计引物；改进操作，避免污染 （3） 出现非特异性扩增带原因：是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体 ；是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关 ；酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特
15、异性扩增 对策：重新设计引 物，降低引物量；适当提高退火温度，减少循环次数 ；减低酶量或调换另一来源的酶（4） 出现偏状拖带或涂抹带原因：酶量过多或酶的质量差；dNTP浓度过高；Mg2+浓度过高；退火温度过低；循环次数过多引起 对策：减少酶量，或换另一种酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；提高退火温度；减少循环次数 。7. RT-PCR、DD-PCR、PCR-SSCP、实时荧光定量PCR原理及应用RT-PCR：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。DD-PCR：利用T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C) 为锚定引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。用于基因表达，基因的鉴定物克隆，分离差异表达基因。PCR
