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1、 淮 阴 工 学 院生物催化大作业作 者: 学 号：1101602129学 院:生化学院专 业:生物1101题 目:生物转化法生产木糖醇任课教师： 王朝宇 摘 要 木糖醇是一种具有营养价值的甜味物质，也是人体糖类代谢的正常中间体。在自然界中，木糖醇广泛存在于各种水果、蔬菜中，但其含量很低。商品木糖醇发热量、甜度跟蔗糖相仿，食用后不消耗胰岛素，另具有特殊的防龋功能，可作糖尿病人的营养剂、治疗剂及儿童防龋食品。木糖醇还具备类似甘油和其他多元醇的许多优异特性，因而广泛用于国防、医药、化工、皮革、涂料及食品等行业。传统的化学法生产木糖醇需要一系列复杂的分离纯化步骤，过高的生产成本限制了木糖醇的使用范围
2、。发酵工艺生产木糖醇无需木糖的纯化步骤，是取代化学合成法的一条可行工艺路线。本文主要探讨木糖醇的生物合成途径、木糖醇发酵过程的影响因素和研究的发展趋势。关键词 木糖醇，生物转化，发酵，生物合成1 木糖醇的生物合成途径自然界中能够利用木糖的微生物种类很多，包括细菌、放线菌、霉菌以及酵母菌等。但能合成木糖醇的微生物并不多。1.1 产木糖醇的微生物根据已有的研究，在自然界的微生物当中只有很少一部分细菌可以生成木糖醇，丝状真菌产木糖醇的效率也不高，而酵母则比较容易将木糖转化生成木糖醇。已经发现，产木糖醇性能优越的酵母菌株主要集中于假丝酵母属；部分属于徳巴利酵母属和管囊酵母属。1983年，Bruinen
3、berg等人研究Candida utilis在不同的碳源和氮源的情况下对NADPH的消耗量和木糖醇产量。他们认为在木糖代谢中，NADPH主要来源于磷酸己糖途径和异柠檬酸脱氢酶的作用。几年前，有研究认为NADPH依赖的木糖还原酶和NAD依赖的木糖醇脱氢酶之间的氧化还原作用不平衡是木糖醇积累的主要原因。Kotter等人于1990年构造Saccharomycess cerevisiae菌株。第二年，Hallbom等人已经利用转化的酿酒酵母菌株(S.cerevisiae)以木糖为碳源发酵生产出木糖醇，并成功获得95的木糖醇转化量。1993年，Kotter和Ciriacy研究认为，NADPH的不足是酿酒
4、酵母代谢工程菌进行木糖发酵的瓶颈。然而。在限氧条件下，改变酿酒酵母(S.cerevisiae)的戊糖磷酸途径，为木糖代谢提供充足的NADPH，是很困难的。由此，在酵母发酵产生木糖醇的研究中，NADPH在酵母木糖代谢中的作用便成为研究的焦点，并且一直延续至今。1.2 酵母生产木糖醇的机制假丝酵母菌属的酵母通过如图1所示的代谢路线生产木糖醇。木糖原料首先在木糖还原酶（XR）作用下还原成木糖醇。然后在木糖醇脱氢酶作用下氧化生成D木糖。D木糖磷酸化以后，通过戊糖磷酸代谢路线代谢。相对于第一个反应的催化剂主要利用的辅酶NADPH，第二个反应的催化剂XDH（木糖醇脱氢酶）是利用NAP+作为辅助酶发生作用的
5、，XR是利用NADPH和NADH两者而存在。酵母细胞内NADP主要通过戊糖磷酸的代谢路线转化成NADPH。另一方面NADH在好气条件下经过呼吸反应链（氧化的磷酸化）的反应后，再生成NAD+。图1.重组枯草芽孢杆菌合成木糖醇的代谢路线生产木糖醇的酵母在微好气条件下（溶存氧质量浓度：0.1mg/L1mg/L）累积木糖醇最多，在这种限制供氧条件下，木糖的代谢过程由于不能充分地将NADH再生成NAD+，因此细胞内NADH浓度高。其结果是：一方面XDH阻碍了由木糖醇迅速转化为木糖的氧化反应，因此木糖醇积聚了起来。另一方面，在完全的好气条件下，由于通过呼吸链NADH充分再生成NAD+，因此木糖醇被迅速的代
6、谢过程耗尽了，积蓄的量也就减少了。同时，在嫌气条件下，在木糖醇利用的能力显著低下的同时，乙醇成为主要的生成物了。关于XR与XDH两种辅酶特异性不同，在微好气条件下形成细胞内的氧化还原平衡失调，然而他却是累积木糖醇的原因。正如上述的生成机制可以知悉，培养基中溶存氧的浓度是可以影响木糖醇生产的最重要因素。其余原因，如培养基组成、基质（木糖）的浓度、辅助基质、氮源、初发菌的浓度等也影响木糖醇的生产。2 木糖醇的主要生产技术2.1 固定化细胞发酵生产木糖醇重复批次发酵半纤维素水解液生产木糖醇，能有效的减小水解液中抑制因子的作用，提高细胞的适应能力。用固定化细胞和重复批次发酵相联合，不仅能提高细胞的稳定
7、性，而且能减小回收利用细胞催化剂的困难，缩短生产时间并减小纯化成本。目前比较有效的方法是胶体包埋固定化方法。藻酸钙是活细胞固定化最常用的载体。木糖醇是酵母通过氧化还原途径发酵木糖代谢的中间产物(图2)。在限氧条件下，木糖醇的积累达到最大值。因为在此条件下辅园子NADH不能全部被呼吸链氧化成NAD+，所以有足量的NADH辅因子用于供木糖还原酶利用，催化产生木糖醇。相反的，在供氧充足的条件下，术糖几乎全部被用于细胞的生长及分裂，从而不利于术藉醇的积累。2.2 细胞循环发酵生产木糖醇细胞固定化技术可以提高产量。但是，到细胞的传质速率太低。为了解决这个问题，利用带中空纤维膜的细胞循环发酵系统来保持发酵
8、液中比较高的细胞浓度，从而作为生物催化剂将本糖转变成术糖醇。这样可以在木糖醇生产时有很高的生产力。在细胞循环发酵过程中，发酵液经中空纤维膜过滤后，细胞又循环回到发酵罐，同时向发酵罐中再注入新的培养基。到目前为止生产过程运用的比较系统的细胞发酵流程：3 木糖醇生产的具体步骤（1） 预处理。将发霉、变质的花生壳筛选、分拣出来，用水洗去沙土及污物,破碎至122cm。先在100的温度下,蒸煮60min,把水排除,再加入低浓度的稀盐酸于120蒸煮6090min。（2） 水解。水解就是将花生壳中以多缩戊糖为主组成的纤维素,在酸的催化作用下裂解并与水结合生产糖的过程。以花生壳用量的17%20%的一定浓度的盐
9、酸在水解釜中采用常压水解的方法进行水解。水解温度为120,水解时间为4h左右。（3） 脱色。以粉状和颗粒状混合的活性炭做为脱色剂,采用常压操作,活性炭用量一般为糖液的12%15%。脱色速度要快,温度不要过高。一般控制在7580。（4） 离子交换。此次交换为第一次交换,其主要目的是为了除去水解液中的无机酸和有机酸。CLl是阴离子,所以第一次是采用阴离子交换树脂,阴离子交换树脂可选用大孔阴树脂D296等,它不但可以除去阴离子,还可以吸附除掉很多胶体杂质和色素。（5） 一次浓缩。离子交换除酸后的糖液通过减压蒸发,使糖液浓度提高到30%35%，蒸发时间为8h左右。（6） 离子交换。第二次交换的目的是为
10、了除去灰份和阳离子,所以采用阳离子交换树脂,阳离子交换树脂可选723型强酸阳离子树脂。它不仅可以除去阳离子杂质,还可以吸附除去胶体和非糖体、含氮化合物等。（7） 加氢处理。采用间歇釜式悬浮镍催化加氢,当反应温度为120130,压力为7080kg/cm-2,pH值为6.5左右,剂糖质量比为2%,反应时间为90120min,转化率可达99%以上,产品色度好。（8） 离子交换。第三次交换是为了氢化液的净化,净化后的木糖浆经过加氢会增加酸度和金属离子,要进一步净化,以除去这些杂质,该过程宜采用“阳柱 阴柱 混合床”的组合,混合床的交换负荷特别低,使木糖醇的纯度更高。（9） 二次浓缩。采用真空蒸发结晶。
11、蒸发浓缩前,先过滤除去氢化液中其他杂质及少量催化剂细未,蒸发浓缩过程温度控制75,真空度700mm汞柱以上。当浓缩液含醇量为90%时,既可进入结晶环节。（10） 结晶、成品。当醇膏温度降到64左右加入适当晶种,慢慢搅拌助晶,每小时降温l,直到比室内温度稍高时,即可分离取得成品。4 木糖醇生产的几个主要的影响因素4.1 氮源木糖醇的积累受氮源的显著影响，适宜的氮源及浓度在不同培养基、不同pH条件及酵母菌株之间存在很大差异。有机氮源可降低C.shehalale XDH水平。酵母膏是最好的有机氮源。用稻草半纤维素水解物培养C.guilliermondii。在pH为4.5时用尿素作氮源比硫酸铵好，木糖
12、醇转化率提高2.5%，而在pH=5.3,pH=6.0的条件下，则这两种氮源无明显差异。一些学者混合使用有机氮与无机氮源，取得很好的效果。4.2 葡萄糖含量的影响葡萄糖的存在，是影响酵母发酵木糖生产木糖醇的一个关键因素。Sang等在Candida parapsilosis发酵木糖和葡萄糖的混合液时，葡萄糖先被消耗。这样在木糖被利用前就有个延滞期以合成木糖代谢所必需的酶。葡萄糖含量低于5g/L时木糖醇的产量不会降低，因为葡萄糖进行的是有氧代谢，不产生乙醇。而当葡萄糖的浓度大于5g/L时，有氧代谢消耗不掉的部分便通过无氧代谢而产生乙醇，木糖醇的产量降低。他们认为由于木糖生成木糖醇和葡萄糖生成乙醇的反
13、应均为还原反应，会竞争氧化还原势，从而当葡萄糖超过一定的量，发生无氧代谢产生酒精时就会抑制木糖醇的生成。也有人认为葡萄糖的存在可能会抑制将木糖转化为木糖醇过程中的关键酶木糖还原酶的活力，从而导致木糖醇的产率降低。章克昌等采用活性干酵母消耗掉水解液中的葡萄糖，可以大大提高水解液的发酵速度和木糖醇的转化率。4.3 pH和温度的影响由于只有分子态的乙酸才具有抑制作用，因而乙酸的抑制作用与pH值有很大的关系。用Candida parapsilosis发酵蔗渣水解液，在pH=7.0和氧化速率10mmol/（Lh）和22.5mmol/（Lh）时，直到发酵终点乙酸也未耗尽，而在同样的pH下，氧传质速率为35
14、mmol/（Lh）时，乙酸迅速耗尽，其抑制作用可忽略不计；当初始pH为4.0时，氧传质速率为22.5mmol/（Lh）和35mmol/（Lh），乙酸均会迅速耗尽，即使在氧传质速率为10mmol/（Lh）下，至发酵终点，乙酸也会耗尽。但在发酵效果上，木糖醇的浓度、木糖醇的产率和木糖的消耗速率却是在pH=7.0时最高，此时木糖醇的产率达79%。pH和温度会影响木糖醇发酵的两个关键酶木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活力，Senc等人的研究发现，对于Candida guilliermondii发酵蔗渣水解液时，pH为4.0到6.0时木糖还原酶的活力最高，而木糖醇氧化酶的活力随着pH和温度的上升而上升，在pH
15、为6.5和35的温度时木糖醇脱氢酶的活力最高而木糖的转化率和木糖醇的生产速率均在pH为6.5和35的温度时达到最大。同时木糖醇的存在对于此种菌的木糖醇脱氢酶的活力没有影响，由此可见木糖醇的最佳生产条件与使木糖醇脱氢酶活力最低及木糖还原酶的活力最高的条件并不一致。由于氮源在发酵过程中的分解会使发酵过程中的pH发生变化，所以使用不同氮源时使木糖醇产率最高的pH并不相同。如在用Candida guilliermondii发酵稻草半纤维素水解液时，若使用硫酸铵为氮源，则产醇的最佳平pH为5.3，而使用尿素为氮源时，最佳pH则为4.5。这是因为在发酵过程中，尿素会分解生成氨和二氧化碳，从而使发酵液的pH升高。因此在考虑最佳的发酵pH时，也应考虑氮源的因素。5 利用生物转化生产木糖醇的发展趋势5.1 应用细胞固定化技术有研究者试图将细胞固定化技术用于木糖醇的生产#通过采用细胞固定化技术，常可以使成批培养变成连续培养，同时由于细胞浓度较高，因而能在较长的工艺时间保持稳定的活性，使供给细胞的营养物质要比普通工艺少得多，并且由于转化物的不断排出，因而使细胞活性的调节、有毒物质代谢产物的形成以及细胞活性的降低等类似问题都比悬浮细胞工艺更易解决。Roca等使用酿酒酵母的重组体进行了固定化细胞生产
