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1、生物分离工程实验超声波提取植物总黄酮分离提取及鉴定 一、实验目的为充分利用天然植物资源，避免资源的浪费，探讨植物总黄酮的提取及鉴别方法 。二、实验原理采用超声波乙醇浸提法从植物材料（银杏叶或菊花）中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行验证，并用分光光度法测定含量。利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响。三、实验材料原料：银杏叶、菊花或其它含黄酮化合物的植物材料，如新鲜芹菜买自市农贸市场。试剂：95%乙醇AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；氢氧化钠AR；三氯化铝
2、AR；盐酸AR；氨水AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）四、实验仪器KQ5200DB型数控超声波清洗器（超声工作频率40kHz、宁波新芝超声仪器有限公司）；UV 755B紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。五、实验步骤（一）总黄酮成分提取 取新鲜芹菜叶或干燥植物材料，烘干后粉碎。称取粉末约6 g，加80 ml 95%乙醇，超声波提取0.5 h或不同时间，抽滤。滤渣再加80 ml 95 %乙醇，再次超声波提取0.5 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至
3、滤液仅剩57 ml为止，放置100 ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液。（二）定量实验-总黄酮的含量测定以芦丁为对照品测定植物材料中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。1. 波长的选择取样品液适量，在0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在420700 nm波长范围测定络合物的吸光度，络合物于510 nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。2. 标准曲线的绘制分别精密吸取芦丁对照液（0.13 mg/ml）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.
4、00，5.00 ml于10 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠溶液4.00 ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12 min，以试剂作空白参比液，于510 nm处测定吸光度 根据上表求得回归方程3. 提取物含量的测定精密吸取样品液0.50 ml，置10 ml容量瓶，按标准曲线的制备方法，测定其吸光度A=0.137，根据回归方程计算样品中总黄酮的含量（mg/mL）。（三）定性实验-总黄酮的鉴别1. 颜色反应：（1）紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在
5、紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。（2）浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏30 s，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。（3）三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。（4）乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。 。2. 纸层析：取样品溶液10 l点在滤纸上。用正丁醇醋酸水=415（体积比）为展开剂，上行展开5 h，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。六、实验讨论1. 利用本文所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度
6、较高。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。2. 黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛
7、、免疫调节、降血糖、 治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目，分布广泛。因此，植物黄酮的开发利用有重要意义价值，值得综合利用以加强资源开发。生物分离工程实验1牛奶中酪蛋白的分离和纯化 一、原理酪蛋白是牛奶中的主要蛋白，其浓度为3.5g/100ml牛奶。实际上酪蛋白是一种含磷蛋白质的复杂混合物。不是单一化合物。酪蛋白的等电点为4.8，且不溶于乙醇。利用这两个性质可将酪蛋白和其它蛋白分开，并除去脂类。二、试剂0.2mol/L的pH=4.6醋酸钠缓冲溶液、牛奶、乙醇、四氢
8、呋喃三、实验步骤取牛奶50ml置于250ml烧杯中，加入至40。边搅拌边加入100ml（40）的醋酸钠缓冲液直至pH=4.8。将悬浊液冷却至室温，静止5min后抽滤。用少量水将沉淀洗涤几次，在悬浮于30ml乙醇中，抽滤。用乙醇四氢呋喃混合液洗涤，四氢呋喃洗涤，抽滤。烘干、称重。四、计算算出每百毫升牛奶中酪蛋白含量。以3.5%为理论值，计算收率。生物分离工程试验纸层析观察转氨基作用 实验目的学习氨基酸纸层析的基本原理掌握氨基酸纸层析的操作原理实验原理转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应。在转氨酶的催化下，氨基酸的氨基与酮酸的酮基的互换反应称为转氨基作用。每种转氨基反应均由专一的专氨酶催化，
9、转氨酶广泛分布于肌体各个组织和器官。本实验用纸层析法观测酮戊二酸与丙酮酸在肝脏丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化下的转氨基作用。实验组发生转氨基反应，在最后的体系中才存在两种氨基酸；而对照组不发生转氨基反应，最后体系中只有反应物中的一种氨基酸，用煮沸方法是得ALT失活而中止反应，然后用纸层析法对两种氨基酸进行分离鉴定。纸层析按操作方法分成两类即垂直型和水平型。垂直型是将滤纸悬挂，使流动向上或向下扩散，水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。纸层析法的分离原理是分配层析，分配层析是利用混合物在两种或两种以上的不同溶剂中的总分配系数的不同而使物质分离的方法，相当于一种连续的萃取过程。纸层析
10、以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。某些与水不相溶的有机溶剂如醇、酚等为常用流动相。把预分离的物质夹在指的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续，动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中分配趋势加大的组分，随着流动相移动的就慢；反之，在流动相分配趋势加大的成分，移动速度就快，最终不同的组分彼此分开。物质在纸上的移动速度可以用比移值（Rf）表示：物质在在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故必移值也相对恒定，因此在同一层析体系中可以用Rf值来鉴别被分离的物质。用纸层析分离氨基酸混合物时，影响RF制的主要因素是侧链基
11、团的极性。例如丙氨酸侧链极性要小于谷氨酸侧链的极性，所以在混合物中丙氨酸在滤纸上运动要快。Rf值大，而谷氨酸在滤纸上的运动速度要慢，Rf值小。1 实验材料和仪器1 仪器 剪刀；镊子；托盘；培养皿；毛细管；喷雾器；吹风机；水浴箱；电炉。2 试剂（1）pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液；取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液81 ml和0.2 mol/L磷酸二氢钠19ml混匀，用蒸馏水稀释20倍。（2）0.2 mol/L丙氨酸溶液：称取并氨酸0.891g先溶于少量pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液，以1mol/L氢氧化钠仔细调节至PH 7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。（3）0.
12、1mol/L -酮戊二酸溶液：称取-酮戊二酸1.461g，先溶于少量的pH7.4 0.010 mol/L磷酸缓冲液中，以1mol/L氢氧化钠仔细调节至PH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。（4）0.1mol/L谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735g先溶于少量的pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液，以1mol/L氢氧化钠仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至50ml。（5）0.5%茚三酮溶液：称取茚三酮0.5g溶于100ml丙酮中。（6）层细溶液（酚的饱和溶液）：将重蒸过的酚2份和水1份（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中，振荡，静置24小时分层，将下部酚层转移到瓶中备用。2 实验步骤
13、1肝均浆制备：取新鲜的动物肝0.5g，在研钵中剪碎，研成均浆，加入9倍体积（4.5 ml）pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液。2转氨基反应：取干燥小试管（或离心管）二支，分别标明测定管与对照管，加入肝均浆10滴，测定管加入37水浴保温10分钟，对照管放入沸水中煮10分钟，待对照管冷却后，于两试管中分别加入0.1mol/L谷氨酸10滴，0.1mol/L -酮戊二酸10滴，pH7.4 10 mol/L磷酸缓冲液1.5ml，摇匀，放进37水浴保温30分钟，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮熟10分钟，以终止反应，去除冷却后，过滤。取滤液备用。3层析：取直径9cm圆形滤纸一张，用圆规作半径
14、1cm同心圆，通过圆心作两条相互垂直的线（见图），在2、3两处分别点测定管和对照管上清液1-2滴。方法是用毛细管在纸上点样，注意斑点不可太大（一般直径0.5cm）而且每点一滴需干燥后方可点第二滴，在2、4两处则各加0.1mol/L丙氨酸和0.1molL谷氨酸1-2滴。在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小）另取同类型滤纸约1cm2,下剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，插入小孔（勿使突出滤纸面）。将层析液放入直径3-5cm的表面皿正中，（表面皿放入直径9cm的培养皿正中）将滤纸平放在培养皿上，灯芯浸入溶液中，将另一同样大小的培养皿反盖上（见图2），可见溶液沿灯芯上升至滤纸，再向四周扩散，约25分钟后，溶液
15、前缘距滤纸边缘约cm时即可取出，用吹风机吹干或60烘箱烤干。显色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器喷上0.5%茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部浸润，再用吹风机或60烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。注意事项.层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。.操作中接触滤纸前要洗净手，并尽量避免手与滤纸中间部位接触。. 点样不宜过大，直径小于0.5cm.生物分离工程实验酵母RNA的提制 (最终版) 一、目的：学习和掌握从酵母中提制RNA 的原理和方法，从而加深对核酸性质的认识。二、原理：提取和制备RNA 的首要问题是选RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA（2.6710.0%），DNA 很少（0.030.516），而且菌体容易收集，RNA 也易于分离。此外，抽提后的菌体蛋白质（占干菌体的50%）仍具有很高的应用价值。RNA 提制过程首先要使RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH 调至2.02.5，使RNA 沉淀，进行离心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤RNA 沉淀。提取RNA 的方法很多，在工业
