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1、第四章药物定量分析与分析方法验证 药物分析教研室 Contents 第一节定量分析样品的前处理方法 Pretreatmentofsampleusedinquantitativeanalysis 一 概述 含卤素药物 C X 乙烯型卤和芳卤 烯丙型卤和苄卤 卤代烷型 卤素活泼性 I Br Cl F分子中所含卤原子的个数越多 活泼性越强 同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时 活泼性增强更加明显 三氯叔丁醇 六氯对二甲苯 泛影酸 碘他拉酸 第一节定量分析样品的前处理方法 第一节定量分析样品的前处理方法 不经有机破坏 经有机破坏 直接测定 配位滴定法氧化还原滴定法 水解后测定 碱水解酸水解
2、经还原分解后测定 湿法破坏 凯氏定氮法 干法破坏 高温灼烧法氧瓶燃烧法 第一节定量分析样品的前处理方法 一 直接测定法 葡萄糖酸钙EDTA配位滴定富马酸亚铁邻二氮菲 硫酸铈滴定葡萄酸锑钠间接碘量法 二 经水解后测定法 适用范围 金属原子不直接于碳原子相连或某些C M键结合不牢固的有机金属药物 第一节定量分析样品的前处理方法 1 碱水解法 银量法返滴定 2 酸水解法 适用范围 含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物 EDTA配位滴定 第一节定量分析样品的前处理方法 三 经还原分解后测定法 适用范围 碘原子直接与芳环连接的含碘有机化合物 第一节定量分析样品的前处理方法 三 经有机破坏的分析方
3、法 含氮 硫 硫柳汞 氯化钠的生物制品 含氮有机合成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物基质的去除 H2SO4 HNO3H2SO4 HClO4H2SO4 H2SO4HNO3 KMnO4 分解剂 消化剂 辅助分解剂 凯氏定氮法 测定含有氨基和酰胺结构的药物结构 一 湿法破坏 第一节定量分析样品的前处理方法 原理 将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热 药物分子中有机结构被 消化 成CO2和H2O 有机结合的氮转化为无机氮 与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵 经碱化后释放出氨气 随水蒸气馏出 用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后 再用酸或碱滴定液滴定 常量法 含氮量25 30mg半微量法 含氮量1
4、 0 2 0mg 第一节定量分析样品的前处理方法 凯氏烧瓶 K2SO4 提高消解温度 CuSO4 加快消解速度 硫酸 碱液 硼酸 吸收液 甲基红 溴甲酚绿指示剂 硫酸滴定空白校正 二 干法破坏 1 高温灼烧法 用于含卤素 含磷药物和药物中砷盐的检查 常加入无水碳酸钠 硝酸镁 氢氧化钙 氧化锌等辅助灰化 2 氧瓶燃烧法 第一节定量分析样品的前处理方法 系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的密闭的燃烧瓶中充分燃烧 使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O 待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物 被吸收于适当的吸收液中 再根据其性质和存在方式选择方法进行分析 第一节定量分析样品的前处
5、理方法 第一节定量分析样品的前处理方法 第一节定量分析样品的前处理方法 示例碘苯酯的含量测定 取本品约20mg 精密称定 照氧瓶燃烧法进行有机破坏 用NaOHT S 2ml与H2O10ml为吸收液 待吸收完全后 加溴醋酸溶液10ml 密塞 振摇放置数分钟 加甲酸约1ml 用水洗涤瓶口 并通入空气流约3 5min 以除去剩余的溴蒸气 加KI2g 密塞 摇匀 用Na2S2O3液 0 02mol L 滴定 至近终点时 加淀粉指示液 继续滴定至蓝色消失 并将滴定的结果用空白试验校正 每1ml的硫代钠液 0 02mol L 相当于1 388mg的C19H29IO2 C19H29IO2分子量为416 34
6、 C19H29IO2 6Na2S2O3 滴定度 T 416 34 1 6 0 02 1 338 mg 第一节定量分析样品的前处理方法 第二节定量分析方法的特点 一 容量分析方法 1 滴定度 每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物浓度 被测药物 滴定液 第二节定量分析方法的特点 第二节定量分析方法的特点 示例一Vc的含量测定 碘量法测定Vc含量 M C6H6O6 176 13 C I2 0 05mol L 示例二异烟肼的含量测定 溴酸钾法测定异烟肼含量 M C6H7N3O 137 14 C溴酸钾 0 01667mol L 第二节定量分析方法的特点 示例三葡萄糖酸锑钠的含量测定 Sb5 2S2O
7、32 示例四司可巴比妥钠的含量测定 第二节定量分析方法的特点 取本品约0 1g 精密称定 置250ml碘瓶中 加水10ml 振摇使溶解 精密加溴滴定液 0 05mol L 25ml 再加盐酸5ml 立即密塞 并振摇1min 在暗处放置15min后 注意微开瓶塞 加碘化钾试液10ml 立即密塞 摇匀后 用硫代硫酸钠滴定液 0 1mol L 滴定 至终点时 加淀粉指示液 继续滴定至蓝色消失 并将滴定得的结果用空白试验校正 M 260 23司可巴比妥 溴 1 1 W 0 1022g F 1 038 V 15 73mlV0 23 21 第二节定量分析方法的特点 习题一剩余碘量法测定异烟肼含量 异烟肼在
8、弱碱性溶液中 加定量过量的碘滴定液 0 1mol L 氧化 反应完成后 酸化 剩余碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液 0 1mol L 滴定 以淀粉为指示剂 第二节定量分析方法的特点 习题二非那西丁含量测定 精密称取本品0 3630g加稀盐酸回流1小时后 放冷 用亚硝酸钠液 0 1010mol L 滴定 用去20 00ml 每1ml亚硝酸钠液 0 1mol L 相当于17 92mg的C10H13O2N 请计算非那西丁的含量 第二节定量分析方法的特点 二 光谱分析法 一 紫外 可见分光光度法 仪器校正空白溶剂校正吸收峰波长确定A 0 3 0 7 第二节定量分析方法的特点 含量测定方法 1 对照品比较法
9、原料药 制剂 2 吸收系数法 习题一维生素B2含量测定 取本品75mg 精密称定 置烧杯中 加冰醋酸1ml与水75ml 加热溶解后 加水稀释 放冷 移置500ml量瓶中 加水稀释至刻度 混匀 精密量取10ml 置100ml量瓶中 加1 4 醋酸钠溶液7ml 并用水稀释至刻度 摇匀 照分光光度法在444nm的波长处测吸收度 按维生素B2的吸收系数为323计算 第二节定量分析方法的特点 第二节定量分析方法的特点 3 计算分光光度法4 比色法 特点 灵敏度高 可达10 10 10 12g ml要求低浓度下测定须做空白测定荧光弱的药物可衍生化后测定 第二节定量分析方法的特点 二 荧光分析法 第二节定量
10、分析方法的特点 三 色谱分析法 1 HPLC 示例一炔诺酮的含量测定 照高效液相色谱法 附录 D测定 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 以甲醇 水 65 35 为流动相 检测波长为244nm 理论塔板数按炔诺酮峰计算不低于1500 炔诺酮峰与内标物质峰的分离度及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要求 内标溶液的制备取黄体酮约25mg 精密称定 置25ml量瓶中 加甲醇溶解并稀释至刻度 第二节定量分析方法的特点 测定法取本品约25mg 精密称定 置25ml量瓶中 加甲醇溶解并稀释至刻度 摇匀 精密量取此溶液2ml与内标溶液3ml 置10ml量瓶中 加甲醇稀释至刻度
11、 摇匀 取20 l注入液相色谱仪 记录色谱仪 记录色谱图 另取炔诺酮对照品适量 精密称定 同法测定 按内标法以峰面积计算 即得 2 GC 第二节定量分析方法的特点 示例松节油的含量测定 照气相色谱法 附录 E测定 色谱条件与系统适用性试验用聚乙二醇 PEG 20M为固定相 涂布密度为20 柱温为90 C 理论塔板数按 蒎烯峰计算应低于1500 校正因子测定取正丁醇适量 精密称定 加石油醚 30 60 C 制成每1ml含20mg的溶液 作为内标溶液 另取 蒎烯对照品约30mg 精密称定 置10ml棕色量瓶中 精密加入内标溶液2ml 加石油醚 30 60 C 至刻度 摇匀 吸取1 l注入气相色谱仪
12、 计算校正因子 第二节定量分析方法的特点 测定法取本品约35mg 精密称定 置10ml棕色量瓶中 精密加入内标溶液2ml 用石油醚 30 60 C 溶解并稀释至刻度 摇匀 吸取1 l注入气相色谱仪 测定 即得 本品含 蒎烯 C10H16 不得少于70 第三节药品分析方法的验证 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则药物稳定性试验指导原则缓释 控释制剂指导原则微囊 微球与脂质体制剂指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则 目的 证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求效能指标 评价分析方法的尺度 效能指标包括 精密度 准确度 检测限 定量限 选择性 线性与范围 耐用性 第三节药品分析方法的验
13、证 一 准确度 accuracy 系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度 一 含量测定方法 回收率 Recovery 回收试验 加样回收试验 3 3 至少9个测定结果 第三节药品分析方法的验证 二 精密度 Precision 系指在规定的测试条件下 同一个均匀供试品 经多次取样测定所得结果之接近的程度 表示 偏差 d 标准偏差 s 相对标准偏差 RSD 重复性 同一实验室 同一人多次测定的精密度中间精密度 同一实验室 不同人 不同仪器测定的精密度重现性 不同实验室 不同人测定的精密度 第三节药品分析方法的验证 三 专属性 Specificity 指有其他成分 杂质 降解物 辅料等 可
14、能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性 目视法信噪比法S N 3 四 检测限 LimitofDetection LOD 药物能被检出的最低浓度 g ml 五 定量限 LimitofQuantitation LOQ 药物能被定量测定的最低浓度 g ml 信噪比法S N 10 第三节药品分析方法的验证 影响因素 被测溶液的稳定性 流动相的组成和pH 商品柱的品牌 柱温等 六 线性与范围 LinearityAndRange 待测结果 响应值 与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系的程度 Y a bx r 0 9999 七 耐用性 Robustness 测定条件稍有变动时 对测定结果的影响程度
15、 第三节药品分析方法的验证 已有重现性验证 不需验证中间精密度 如一种方法不够专属 可用其他分析方法予以补充 视具体情况予以验证 第三节药品分析方法的验证 各种含量测定方法对效能指标的要求 1 容量分析法用原料药精制品 含量 99 5 或对照品考察方法的精密度 RSD 0 2 回收率一般在99 7 100 3 之间 2 UV法用适当浓度的精制品进行测定 其RSD 1 制剂的测定 回收率一般应在98 102 之间 3 HPLC法要求RSD 2 回收率98 102 之间 第五章生物制品分析方法的基本要求 一 常用样品的种类 采集和贮藏 一 血样 血浆 plasma 血清 serum 全血 二 唾液
16、 三 尿液用于药物剂量回收 尿清除率 生物利用度 药物代谢物及其代谢途径 类型 速率等的研究 临床上用于判断患者是否违反医嘱用药 第四节生物制品分析方法的基本要求 二 生物样品分析前处理技术 有机破坏 硝酸 高氯酸消化 第四节生物制品分析方法的基本要求 第四节生物制品分析方法的基本要求 用有机溶剂 甲醇 冲洗 洗净 用水冲洗 活化 上样 用水或缓冲液冲洗 洗去内源性物质 有机溶剂洗脱药物收集洗脱液 第四节生物制品分析方法的基本要求 三 定量分析方法的验证 药典附录 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则 国家食品药品监督管理局新药评审中心化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则 第四节生物制品分析方法的基本要求 一 特异性所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物 内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定 第四节生物制品分析方法的基本要求 二 标准曲线与线性范围 Y 9 566 10 2X 6 153 10 3r 0 9995 至少6个浓度点建立标准曲线线性范围必须覆盖全部待测
