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1、星点设计-效应面法优化壳聚糖温敏凝胶的制备及缓释性考察李晓娟， 基金项目 国家自然科学基金(81160395)作者简介 李晓娟(1987- )，女，硕士研究生，联系电话：15999294455，E-Mail: lixiaojuan_通讯作者 陈文(1967- )，男，教授，从事药物新剂型研究，联系电话：13179930326，E-Mail: chen-郭亚可，韩 博，陈 文 (新疆石河子大学药学院，新疆 石河子 832000)摘要 目的：通过壳聚糖/-甘油磷酸钠（Chitosan/-Glycerophosphate, CS/-GP）温敏凝胶制备工艺的优化，为缓释载体的研究提供基础。方法：通过考
2、察壳聚糖的脱乙酰度（degree of deacetylation, DD）、壳聚糖质量、-GP浓度和pH，选取-GP浓度和pH为星点设计考察因素，胶凝时间为考察指标，对结果进行多元线性和多项式拟合，效应面法优化工艺，并以神经生长因子（-nerve growth fator, -NGF）为模型药物，考察CS/-GP温敏凝胶的缓释性，初步探讨其释药模型。结果：根据复相关系数可知，因素与指标之间的最佳拟合方程为三次多项式，最优工艺：-GP浓度为511.51 mgmL-1，pH为7.08，胶凝时间为6.23 min。且释药行为接近Weibull模型。结论：星点设计-效应面优化的CS/-GP温敏凝胶工
3、艺，具有胶凝时间短和缓释性好等优点，可满足植入给药的要求。关键词 星点设计；效应面法；温敏凝胶；神经生长因子；缓释Study on preparation and sustained-release of chitosan thermosensitive hydrogel by central composite design and response surface methodologyLI Xiao-juan , GUO Ya-ke, HAN Bo, CHEN Wen(School of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang, 8
4、32000, China)Abstract Objective: The purpose was to optimize the preparation process of chitosan/-glycerophosphate (CS/-GP) thermosensitive hydrogel and to lay a foundation for further research of sustained-release delivery system. Methods: By examining the degree of deacetylation (DD) of chitosan,
5、the quality of chitosan, -GP concentration and pH, the study select the -GP concentration and pH as investigation factors, gelling time as index, The results were to fit multiple linear or polynomial and to optimize the process by response surface methodology. The study on Sustained-release of CS/-G
6、P temperature-sensitive gel as a model drug of nerve growth factor (-NGF), and explore its release model. Results: The results of the multiple correlation coefficient shows that the best-fit equation between the factors and indicators for the cubic polynomial, the optimum: the concentration of -GP w
7、as 511.51 mgmL-1, pH was 7.08, gel time was 6.23 min, and the release behavior was close to the Weibull model. Conclusion: The optimization of CS/-GP temperature sensitive gel by central composite design-response surface has the advantages of short gel time and sustained-release to meet the requirem
8、ents of implantable drug delivery.Key Words central composite design; response surface methodology; thermosensitive hydrogel; nerve growth factor; sustained-release神经生长因子是1952年由意大利科学家丽塔L蒙塔尔奇尼（Rita L Montalcin）发现的第一个神经营养因子，其具有营养、保护神经元及促进突起生长等多重生物学功能1，它对中枢及周围神经元的生长、分化、发育、修复、再生和功能特性的表达具有重要调控作用2, 3。但神经生
9、长因子半衰期短4，所以采用不同载体材料制备-NGF缓、控释制剂是最有潜力的手段。2000年Chenite等5成功制备了首个以天然高分子为主的温敏性水凝胶壳聚糖/磷酸甘油二钠盐水凝胶。目前对于壳聚糖/甘油磷酸盐温敏水凝胶体系的研究主要集中在生物相容性、流变学、形貌学以及其在缓释释药骨架材料的应用等方面68。Ruel-Gariepy等9研究发现：纯壳聚糖溶液在4h内就释放了50%的药物，而CS/GP凝胶仅释放15%的药物，释药时间明显延长。张维颖等10制备了负载阿霉素的CS/GP凝胶，发现该载药系统具有初始浓度大，恒定释放的特点，且该凝胶在短时间内发生凝胶化，注射至肿瘤内能均匀缓慢释药，具有较低的
10、毒副作用。目前，研究最多的是普通凝胶载带神经生长因子，对于温敏凝胶应用于载带神经生长因子药物方面的，未见报道。 效应面优化法（Response Surface Methodology, RSM）集数学和统计学为一体，能够准确找到较佳的处方配比或工艺参数，近年来引起了药剂工作者的广泛关注11, 1212。本研究通过单因素考察，最终确定以-GP溶液浓度、pH为考察因素，以胶凝时间为考察指标，采用星点设计-效应面法对壳聚糖温敏凝胶进行工艺优化，以-NGF为模型药物，考察壳聚糖温敏凝胶对药物的缓释性，并初步探讨了其释药机制，为缓释性给药体系研究提供一定的基础。材 料小鼠神经生长因子ELISA试剂盒（美
11、国Chemicon公司）；PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；BP-211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；85-2型数显恒温磁力搅拌器（江苏金坛市华峰仪器有限公司）；HHS11-Ni2型电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；SHA-C型水浴恒温振荡器（江苏省金坛市医疗仪器厂）；Thermo 3001型多功能酶标仪（美国Thermo公司）。壳聚糖（上海蓝季科技发展有限公司）；-甘油磷酸钠（purity 99%，进口分装，上海源叶生物科技有限公司）；磷酸氢二钠（天津市光复科技发展有限公司）；盐酸（北京化工厂）；-NGF（纯度: 97%，美国Sigma公司）；PBS
12、磷酸盐缓冲液（生工生物工程（上海）有限公司）。方 法1 温敏凝胶的制备称取一定量的不同脱乙酰度的壳聚糖，加入5.0 mL 0.1 molL-1的盐酸，室温下，磁力搅拌使壳聚糖充分溶解，得到澄清的壳聚糖溶液。另取一定质量的-GP，溶于1.0 mL去离子水中，混合均匀得到澄清的-GP溶液。然后逐滴加入到CS混合溶液中，磁力搅拌30.0 min，测定pH，用饱和磷酸氢二钠溶液调节pH至不同值。含药温敏凝胶制备：向上述壳聚糖溶液中加入20 g/mL -NGF溶液300 L，混合均匀，室温磁力搅拌下，将-GP溶液逐滴加入到壳聚糖混合溶液中，搅拌30.0 min，即得含药温敏凝胶。2 表征手段2.1 温敏
13、凝胶的初始化胶凝温度测定采用倒置法测定其胶凝温度，取凝胶溶液1.5 mL，注入安瓿瓶中，将装有CS/-GP溶液的安瓿瓶置于20 水浴中，每隔15 min升温1 ，每隔1.0 min倒置观察溶胶的流动性，取倒置30.0 s溶胶不流动记为溶液已凝胶。2.2 温敏凝胶的胶凝时间测定采用倒置法测定其胶凝时间，取凝胶溶液1.5 mL，注入安剖瓶中，然后放到37.0 水浴中，每隔1.0 min倒置观察溶胶的流动性，取倒置30.0 s溶胶不流动的时间记为胶凝时间。3 星点实验设计3.1 壳聚糖的脱乙酰度对温敏凝胶的影响预实验考察壳聚糖的脱乙酰度、壳聚糖的质量、-GP浓度和pH对温敏凝胶的影响。壳聚糖不同脱乙
14、酰度对初始胶凝化温度（IGT）和pH值的影响如图1所示。由图可知，不同脱乙酰度对温敏凝胶性能的影响较大，脱乙酰度越高，其相变的速度越快，凝胶体系的pH值越大。根据实际需求，脱乙酰度越高越易形成凝胶，因此选用DD=90 %，其胶凝的IGT=35 ,pH=7.08。图1 壳聚糖的脱乙酰度对初始凝胶化温度和pH值的影响（n=3）3.2 壳聚糖的质量对温敏凝胶的影响壳聚糖质量对初始凝胶化温度和pH值的影响如图2。由图可知，随着壳聚糖浓度的增大，体系的IGT降低，pH值逐渐增大。但当壳聚糖质量超过100 mg时，pH超过了7.10，IGT低于30 ，且其在盐酸溶液中不完全溶解，因此，实验选取壳聚糖质量为
15、100 mg。图2 壳聚糖的质量对初始凝胶化温度和pH值得影响(n=3)3.3 -GP的浓度对温敏凝胶的影响不同-GP浓度对胶凝时间的影响。由图3可知，随着-GP浓度的不断的增加，体系pH不断增大，胶凝时间逐渐缩短，实验中发现当-GP浓度小于400 mgmL-1时，不能形成凝胶，而-GP浓度高于900 mgmL-1，其溶解性不好，因此，-GP浓度限定在500900 mgmL-1。 图3 -GP浓度对壳聚糖温敏凝胶胶凝时间和pH的影响（n=3）3.4 不同pH对温敏凝胶的影响pH对CS/-GP温敏凝胶在37.0 下的胶凝时间的影响如图4所示，随着pH值的增大，胶凝时间不断缩短，当pH小于6.90时，2 h未能形成凝胶，pH值小凝胶化时间较长，是因为CS被质子化的氨基较高，链间静电斥力大阻碍链间氢键形成，加入GP后需更多反应时间才能形成交联。但当pH升到7.15，温敏凝胶在37 水浴中在较短时间内就已经凝固，不能满足给药体系条件。因此，选择pH范围为6.907.20。图4 pH对壳聚糖温敏凝胶胶凝时间的影响(n=3)根据以上预实验，选取-GP浓度、pH为考察因素，以胶凝时间为指标，其余为定值。根据星点设计原理，采用星点设计两因素安排实验r=(2
