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1、生物样品预处理的常用方法以及最新进展 1 常用的处理方法 处理方法简介 4 3 目录 2 一 生物样品 生物样品的种类 胆汁 乳汁 脑脊液 泪液 精液 胃液 胰液 淋巴液 粪便等 3 一 生物样品预处理的目的 1 使药物从缀合物及结合物中释放出来 以测定药物的总浓度 2 生物样品介质组成复杂 干扰多 而药物组分是微量的 必须先经过预处理 使纯化 富集 3 为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度 4 为了防止分析仪器的污染 劣化 提高测定灵敏度 准确度 精密度和选择性等 4 二 生物样品预处理的指导原则 生物样品进行预处理时应考虑到的问题 1 药物的理化性质和存在性质2 待测药物的浓度3 药物测定
2、的目的4 选用的生物样品类型5 样品预处理与分析技术的关系 5 二 指导原则 预处理应考虑问题 1 药物的理化性质和存在形式A 酸碱性质 未电离分子的亲脂性 挥发性 涉及药物的提取性质 是否挥发损失以及能否采用GC法a 较亲脂的药物 可用溶剂萃取 也可用烷基键和相硅胶 大孔吸附树脂及亲水型填料SPE等方法 b 亲水性较强且有酸碱性 可电离药物 离子交换柱和离子对液液萃取等 c 亲水性较强但不能电离药物 沉淀蛋白 6 二 指导原则 预处理应考虑问题 1 药物的理化性质和存在形式B 药物在体内的存在形式及蛋白结合率 a 结合蛋白率高 首先去蛋白b 多为代谢缀合物 缀合物水解C 药物的光谱特性及官能
3、团特性 涉及分析仪器的选择以及是否需要衍生化和特殊检测器 紫外吸收强弱 是否用UV检测器含有 NO2 Cl等电负性基团 ECD检测器 7 二 指导原则 预处理应考虑问题 1 药物的理化性质和存在形式D 药物的稳定性 a 易氧化药物 加入抗氧剂b 易被光分解药物 避光c 易被酯酶水解药物 对酶进行灭活 8 二 指导原则 预处理应考虑问题 2 待测药物的浓度浓度越大 预处理要求越低 反之 浓度越小 预处理要求越高 例如 地高辛的治疗血药浓度为1 2ng ml 而水杨酸的治疗血药浓度为20 100 g ml 3 药物测定的目的a 急性中毒病例 快速鉴定所怀疑的药物 尽可能短时间测得 预处理可粗放些
4、b 分别获得酸性 中性或碱性代谢物 要考虑全面 细致 9 二 指导原则 预处理应考虑问题 4 选用的生物样品类型血浆 血清 除蛋白然后提取唾液 离心去粘蛋白尿液 酸水解或酶水解法使缀合物水解头发 有机破坏5 样品预处理与分析技术的关系样品预处理需要的净化程度与所用分析方法是否专属 是否具有分离能力 检测系统对杂质污染的耐受程度有关 10 三 常用的处理方法 常用方法 1 有机破坏法2 除蛋白法3 缀合物的水解4 分离 纯化与浓集5 衍生化法 重点介绍 除蛋白法 液液萃取法 11 三 常用的处理方法 有机破坏法 1 有机破坏法 12 三 常用的处理方法 除蛋白法 蛋白质沉淀 酶解法 去除蛋白 1
5、3 三 常用的处理方法 除蛋白法 1 蛋白质沉淀蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀 precipitation 变性蛋白质一般易于沉淀 但也可不变性而使蛋白质沉淀 在一定的条件下 变性的蛋白质也可不发生沉淀 表面水化层调节pH至等电点蛋白质亲水胶体颗粒凝集析出表面电荷加入脱水剂 14 三 常用的处理方法 除蛋白法 测定血样时 首先应去除蛋白质 去除蛋白质作用 a 可使结合型药物释放出来 以便测定药物的总浓度 b 可预防提取过程中蛋白质发泡 减少乳化的形成 c 可保护仪器性能 如保护HPLC柱不被污染 延长使用期限 15 三 常用的处理方法 除蛋白法 1 蛋白质沉淀方法溶剂解法盐析和
6、脱水加入中性盐蛋白质沉淀加入强酸生成不溶性盐沉淀加入重金属沉淀剂 16 三 常用的处理方法 除蛋白法 A 溶剂解法 加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂 可使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚 使与蛋白质结合的药物释放出来 常用的水溶性有机溶剂有 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 四氢呋喃等 含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1 1 3 时 就可以将90 以上的蛋白质除去 水溶性有机溶剂的种类不同时 析出的蛋白质形状亦不同 并且所得上清液的pH值也稍有差别 如用乙腈或甲醇时 上清液pH为8 5 9 5 用乙醇或丙酮时 上清液pH为9 10 17 三 常用的处理方法
7、除蛋白法 A 溶剂解法 加入与水相混溶的有机溶剂操作步骤 a 水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合b 离心分离 采用超速离心机 10000r min 离心1 2min 使用具塞塑料尖底管 c 取上清液作为样品 将蛋白质粘牢在管底 便于吸取上清液 18 三 常用的处理方法 除蛋白法 A 溶剂解法 加入与水相混溶的有机溶剂优点 1 分辨能力比盐析法高 即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀 2 沉淀不用脱盐 过滤较为容易 3 在生化制备中应用比盐析法广泛 缺点 对具有生物活性的大分子容易引起变性失活 操作要求在低温下进行 总体来说 蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍 19
8、三 常用的处理方法 除蛋白法 B 加入中性盐加入中性盐 使溶液的离子强度发生变化 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来 从而使蛋白质脱水而沉淀 常用的中性盐有 饱和硫酸铵 硫酸钠 镁盐 磷酸盐及枸橼酸盐等 操作 a 按血清与饱和硫酸铵的比例为1 2混合 b 离心 10000r min 1 2min 即可除去90 以上的蛋白质 c 得上清液的pH为7 0 7 7 20 三 常用的处理方法 除蛋白法 B 加入中性盐优点 药物的回收率高 不引起蛋白质变性 注意事项 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度 溶液pH值越接近蛋白的等电点 蛋白质越容易沉淀 21 三 常用的处理方法 除蛋白法 C 加入强酸当
9、pH低于蛋白质的等电点时 蛋白质以阳离子形式存在 此时加入强酸 可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀 常用的强酸有 10 三氯醋酸 6 高氯酸 硫酸 钨酸混合液及5 偏磷酸等 22 三 常用的处理方法 除蛋白法 C 加入强酸操作 a 含药物血清与强酸的比例为1 0 6混合 b 离心 10000r min 1 2min 可以除去90 以上的蛋白质 c 取上清液作为样品 优点 该方法去蛋白迅速简单 且而所需样品量少 组分极少变化 分析 过量的三氯醋酸可经煮沸 分解为氯仿和二氧化碳而被除去 也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法 过量的高氯酸可用碳酸钾 醋酸钾 氢氧化钠等中和 然后加乙醇使产生的高氯酸钾 钠
10、 沉淀而被除去 偏磷酸及硫酸 钨酸可用同法除去 因加入了强酸 上清液呈酸性 pH0 4 在酸性条件下易分解的药物不宜用本法除蛋白 23 三 常用的处理方法 除蛋白法 D 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时 金属阳离子与蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀 常用的沉淀剂有CuSO4 NaWO4 ZnSO4 NaOH等 离心分离后所得的上清液pH分别为5 7 7 3和6 5 7 5 优点 可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处理后进样 简化操作 24 三 常用的处理方法 除蛋白法 2 酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时 常需用酶解法 最常用的酶是蛋白水解酶中的
11、枯草菌溶素 它不仅可使组织溶解 并可使药物析出 枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶 可在较宽的pH范围 PH7 0 11 0 内使蛋白质的肽键降解 在50 60 具有最大活力 25 三 常用的处理方法 除蛋白法 2 酶解法操作 先将被测组织加Tris 缓冲液pH10 5及酶 60 培育1h 用玻璃棉过滤 得澄清滤液 即可供药物提取用 优点 可避免某些药物在酸及高温下降解 对与蛋白质结合牢的药物 如保泰松 苯妥英钠 可显著改善回收率 可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成 当采用HPLC法检测时 无需再进行过多的净化操作 不足 不适用于在碱性下易水解的药物 26 三 常用的处理方法 缀合物
12、的水解 缀合物 药物或其代谢物与内源性物质结合生成的产物 内源性物质 a 葡萄糖醛酸 硫酸 甘氨酸 谷胱甘肽和醋酸等 b 一些含有羟基 羧基 氨基和巯基的药物 可与内源性物质葡萄糖醛酸结合形成葡萄糖醛酸苷缀合物 c 一些含酚羟基 芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物 27 三 常用的处理方法 缀合物的水解 特点 多用于尿中药物或其代谢物 缀合物极性较大 不易被有机溶剂提取 常用方法 a 酸水解 适量盐酸 条件因药而异 b 酶水解 常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或两者的混合酶 一般控制pH值在4 5 5 5 37 培育数小时 28 三 常用的处理方法 缀合物的水解 带入粘蛋白导致乳化 b
13、 酶水解法 29 四 常用的处理方法 分离 浓集 纯化 一 液液萃取 liquid liquidextraction LLE 是传统的分离 分析方法 据检测灵敏度要求 提取后一般需浓集 传统浓集方法 a 在末次提取时加入的提取液尽量少 使被测组分提取到小体积溶剂中 然后直接吸出适量供测定 b 挥去提取溶剂法 挥去溶剂时应避免直接加热 防止被测组分破坏或挥发损失 挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干 对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物 可采用减压法挥去溶剂 30 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 原理 多数药物是亲脂性的 在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度 而血液或尿液中含有的
14、大多数内源性杂质是强极性的水溶性杂质 因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质 从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析样品 31 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 操作 萃取一次 不采用反复萃取的方法 特殊情况 杂质不易除去 萃取液难以挥发干扰测定 用一定pH值的水溶液对含药有机相进行反萃取 backextraction 萃取率不低于50 即可 萃取前加入等量内标 32 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 影响萃取的因素影响萃取的因素 有机溶剂的特性 有机溶剂相与水相的体积及水相的pH值等1 溶剂的选择与纯度要求a 提取率和选择性b 操作是否方便 选择溶剂时应注意以下几点 要了解药物与溶剂的化学
15、结构和性质 根据相似相溶的原理进行选用 要求对药物的未电离分子可溶 而对电离形式的分子不溶 沸点低 易挥散 浓集 无毒 不易燃烧 33 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 影响萃取的因素选择溶剂时应注意以下几点 与水不相混溶 如乙醚 萃取后可混入约1 2 的水份 可能带入一些水溶性杂质 乙醚萃取能力强 易于挥散 浓集 为常用萃取溶剂 可采用无水碳酸钠脱水 减少混入的水溶性杂质量 不易形成乳化 具有较高的化学稳定性和惰性 不影响紫外检测 34 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 影响萃取的因素 提取溶剂 35 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 影响萃取的因素2 有机溶剂相和水相的体积a 有机相与水相
16、 体液样品 容积比为1 1或2 1 b 在实验中考察有机溶剂的最佳用量 3 水相的pH值a 一般规则来说 碱性药物在碱性pH值 酸性药物在酸性pH值介质下提取 b 生物样品一般多在碱性下提取 c 一些碱性药物在碱性pH不稳定时 则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取 d 中性药物在pH7附近提取 36 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 液液萃取法优点 操作方便 具有选择性 药物能与多数内源性物质分离 尤其在使用非专属性的光谱分析时 这一优点更为突出 但这依赖有机溶剂的选择 缺点 a 产生乳化现象 引起药物损失 导致回收率较低 b 有机溶剂易挥发 有毒性 对环保不利 c 不能自动化 注意 1 防止乳化现象的产生a 采用较大体积的有机溶剂进行提取 b 在提取前于水中加入固体氯化钠 c 轻微乳化时 适当转速离心 d 严重乳化时 置低温冰箱中使水相快速冻凝 破坏乳化层再溶化后离心 2 减少吸附a 加入异戊醇b 加入二乙胺 37 四 分离 浓集 纯化 液液萃取法 液液萃取法 离子对萃取法离子对萃取法是用有机溶剂提取离子性药物的方法 原理 离解加入反离子酸或碱性药物带电荷离子脂溶性离子对体液中 亲水性
