RNA的定量和完整性分析

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1、RNA 的定量和完整性分析 RNA 的定量和完整性分析RNA 的完整性可以通过琼脂糖变性电泳分析检测,而含量则通过紫外分光光度计确定。常见的变性电泳有甲醛变性电泳，戊二醛变性电泳等。3.1 甲醛变性电泳检测 RNA 完整性一、材料、试剂和仪器1 材料: 植物总 RNA 5-10g2 试剂:1）加样运载缓冲液（Loading buffer）50% 甘油1mmol/L EDTA (pH 8.0)0.25%溴酚蓝25%二甲苯氰 FF2）10TAE Buffer3）5甲醛凝胶电泳缓冲液：0.1mol/L MOPs (pH7.0)40mmol/L 乙酸钠5mmol/L DETA(pH8.0)4）甲醛,

2、甲酰胺3 仪器: 电泳装置，紫外透射观测仪二、实验程序1 甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制在 250mL 的锥形瓶中准确称量 2g Agarose （Sigama），再加 20mL 10TAE Buffer，144mLDEPC 处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至 50-60加 EB 至终浓度0.5g/mL。在通风橱中加入 36 mL 甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。2 RNA 的甲醛变性电泳1） 样品制备RNA 总量 10g5甲醛凝胶电泳缓冲液 4l甲醛 3.5l甲酰胺 10l加入无菌离心管中混合，95水浴变性 2min(或 55,15min)，取出后放入冰中冷却。2） 加

3、入 2l 无菌的 DEPC 处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度, 以确保 DNA 均匀进入样品孔内; 使样品呈现颜色, 便于加样操作; 能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置. 以 0.5 X TBE 作电泳液时, 溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状 DNA 相同 , 而二甲苯氰 FF 的泳动速率与长 4kb 的双链线状 DNA 相同)3）将胶板浸没在 1甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前 5V/cm 预跑 5min。点样后 3-4V/cm 电泳。4）电泳结束后（溴苯酚蓝迁移到约 8cm 处），紫外灯下观察, 照相。3.2 RNA 含量和纯度的测定一、材料

4、，试剂和仪器1 材料: 待检测的 RNA 样品2 试剂: DEPC-H2O3 仪器: 紫外分析仪，石英比色杯二、实验程序1.开机设定参数 ，具体操作参照仪器说明 。2.用 DEPC-H2O 做空白调零。3.将 RNA 样品按一定的比例稀释于 DEPC-H2O。4.混匀样品后在 230nm 、260nm、280nm 和 310nm 波长下读数，还可扫描动态吸收图谱。三 结果与分析1. 完整的 RNA 的甲醛电泳可明显地观察到 28S 和 18S 两条带(见图 3.1)，并且 28S 大约是 18S的两倍宽。若两条带不明显, 则说明 RNA 部分降解,可能的原因是污染了 RNase, 或操作剧烈。

5、2. 定量测定 DNA 或 RNA，应选 260nm、230nm、 280nm 和 310nm 波长读数。其中 260nm 读数用来估算样品中核酸浓度，310nm 为背景吸收值。1 个 OD260 值相当于 40g/mLRNA。样品浓度（g/mL）=OD260- OD310稀释倍数40OD260/OD280 的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230 估计去盐的程度。对于 RNA 纯制品，其OD260/OD2802.0，OD260/OD230 应大于 2。OD260/OD2802.0 可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD2302 说明去盐不充分,可能是 GIT 污染所致,可以再次沉淀和 70%乙醇洗涤。（A）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图谱(B) 烟草总 RNA 普通琼脂糖凝胶电泳图谱表 1 RNA 的长度与分子量