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1、人类基因组计划原理和基本步骤人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于 1985 年率先提出，于 1990 年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达 30 亿美元的人类基因组计划。序列图的绘制主要采用两大策略: 即逐个克隆法（Clone by Clone）和全基因组鸟枪法（Whole Genome Shot-gun)。逐个克隆法的原理逐个克隆法的原理是 Sanger 双末端终止法。人类基因组框架图全部采用基于 Sanger双脱氧原理的自动化毛细管测序。在 1977 年，英国人 Frederick Sanger 创建了双
2、脱氧链末端合成终止法（chain termination method） ，简称 Sanger 法、双脱氧法或酶法。他发现如果在 DNA 复制过程中掺入 ddNTP，就会产生一系列末端终止的 DNA 链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止 DNA 链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的 ddNTP 决定的。Sanger 双末端终止法的基本原理是利用 DNA 聚合酶，以待测单链 DNA 为模板，以dNTP 为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。具体实
3、验是通过 PCR 来完成的，但与普通 PCR 不同，它只需要一个引物而不是一对。在 4 个相同的反应体系中分别加入普通的 dNTP 以及 4 种不同的 ddNTP（比如体系 1 里面缺少dATP，而有 ddATP,以此类推） 。假设四个体系中分别加入的是 ddATP, ddGTP, ddCTP和 ddGTP 我们就分别把这个叫做 A，G ，C，T 体系，然后每个体系中，会在遇到相应碱基的时候停止反应，这样就产生了一系列长度不一并且分别在以 A,G,C,T 时终止的 DNA片段，比如 A 体系中的 DNA 片段，都是以 A 结尾的 DNA。通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测
4、后，从凝胶底部到顶部按 53方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。逐个克隆法基本步骤逐个克隆法的基本步骤是：物理图谱的构建BAC 克隆的筛选 “工作框架图”的构建序列的全组装与“完成图”构建。物理图谱的构建的基本步骤如下：确定各 STS 序列及其在基因组中的位置 大插入片段基因组文库的构建（BAC 文库）以特定 STS 为标记筛选并定位克隆含有 STS 的克隆在基因组中排序。BAC 克隆的筛选的基本步骤如下：用 NotI、SacI 等处理基因组，通过脉冲场凝胶电泳得 200Kb 左右的大片段 DNA纯化后与载体连接，得到插有外源 DNA 片段的 BAC 载体通过电转化将连接产物导入大
5、肠杆菌感受态细胞，在含有抗生素的筛选培养基中筛选带有相同外源 DNA 片段的单克隆菌落“STS-PCR 反应池 ”方案筛选种子克隆相互间具有重叠片段的 BAC 克隆根据 STS 信息组装成 contig，并定位于基因组上。值得注意的是，STS 的密度尚未达到绘制高精度物理图谱的要求，且在基因组中的分布不均匀，造成很多区域没有阳性克隆覆盖,形成空洞。因此需用指纹图谱（FPC 法）或末端序列（Walking by End Sequence)步移等手段对种子克隆进行延伸，形成连续克隆群。利用延伸方法筛选得到的克隆称为延伸克隆。 “工作框架图”的构建：根据序列与 STS database 进行 bla
6、stn 比较结果，将克隆定位末端序的比较，判定延伸在 contig 外的一端序列。并可及时进行 walking，筛选新的克隆。鸟枪法鸟枪法或霰弹法是一个高度计算机化的方法，它是先把基因组随机分成已知长度(2000 个碱基对、 1 万个碱基对、5 万个碱基对)的片段，然后用数学算法将这些片段组装成毗邻的大段并确定它们在基因组上的正确位置。人类基因组计划中塞莱拉公司的科学家先用霰弹法测序 DNA，并将整个基因组覆盖 8次，然后用两个数学公式将人类基因组序列多次组装起来，确定出了基因中的转录单元，预测出 60%的已识别基因的分子功能。最后研究人员将人类基因组信息与此前已完成的果蝇和线虫的基因组序列进行比较，从而找出了三者共有的核心功能。鸟枪法的工作流程图：两种方法对比表
