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1、 PlatformTechnologiesofBiology生物技术平台的两根支柱 细胞培养技术 单克隆抗体技术 细胞培养技术 林旭瑷副教授医学院病原生物学系 林旭瑷 办公室 医学院科研C817电话 88208294实验室 科研C804 810E mail lxai122 关于考试 开卷 实验课结束前上交 10 26 10 27 A4纸张打印试题 手写答案附后 10 40 50 参考书 谷鸿喜 张凤民 凌虹 细胞培养技术 北京大学医学出版社 2012章静波 组织和细胞培养技术 人民卫生出版社 2011谭玉珍 实用细胞培养技术 高等教育出版社 2010 一 绪论二 细胞培养基础知识培养前准备 培
2、养基 培养设备三 细胞培养基本技术培养技术 培养物的固定 染色 显微镜观察四 细胞培养中的细节问题 内容 组织培养的诞生与发展简史组织培养的优缺点组织培养常用术语组织培养的实际意义细胞系或细胞株的命名 绪论 细胞培养 cellculture 从动物体内取出细胞或者组织 模拟体内的生理环境 在无菌 适温和丰富的营养条件下 使离体细胞或者组织生存 生长并维持结构和功能的一门技术 细胞培养 组织培养和器官培养 将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞 做成细胞悬液 再培养于固体基质上 成单层细胞生长 或在培养液中呈悬浮状态培养的技术 A 细胞培养 一 组织 细胞 培养发展史年鉴 1878Claude
3、Bernard 证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持 1885WilhelmRoux 在一个生理溶液中维持一块鸡胚的活性并观察其发育 从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关 1907RossHarrison 利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基 在体外培养青蛙神经嵴 维持其活性达数星期 并观察到了神经纤维的生长 从而解决了神经纤维的来源问题 RossHarrison被人称为细胞培养之父 1910Burrows 率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞 1911Lewis 以海水 血清 胚胎提取物 盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液 并观察到了单层细胞的有限生长 1916Rous Jo
4、nes 开创用胰酶来收获贴壁生长的细胞 1923 1931Carrel 研制T型培养瓶大规模培养细胞 1927Carrel Rivera 制造了第一个病毒疫苗 牛痘疫苗 1933Gey 发明了转管培养细胞的技术 一 组织 细胞 培养发展史年鉴 1948Fisher 研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006 1952Gey和同事 分离培养了HeLa细胞 1952Dulbecco 发明了噬斑法 用长满的单层细胞检测病毒 1954Abercrombie 观察到了体外培养细胞接触抑制的现象 1961Hatflick Moorhead 发现人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡 1965Ham
5、 配制了第一个无血清培养液 1975K hler Milstein 成功得到第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株 一 组织 细胞 培养发展史年鉴 1 研究的对象是活细胞能长时间 直接观察 研究活细胞的形态 结构 生命活动等 二 细胞培养的优点 2 研究条件可以人为控制选择对象 均一性 重复性 类型 性质 阶段 调节条件 化学 物理 生物等因素条件研究方法 各种研究技术 记录方法 3 研究的范围比较广泛学科多 细胞学 免疫学 肿瘤学 生物化学 遗传学 分子生物学等对象广 各种动物 低等动物 高等动物 人类一种动物 不同年龄 不同组织 正常或异常 肿瘤 二 细胞培养的优点 4 研究的费用相对较经济可提
6、供大量 同一时期 重复性好的 生物学性状相似的实验对象 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同 当细胞被置于体外培养后 生活在缺乏动态平衡的环境中久了 必然发生变化 1 与体内主要不同相对孤立 单一缺乏体内的系统作用 失去神经体液的调节和细胞相互间的影响2 主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不明显 细胞趋向单一化 二 细胞培养的缺点 对于体外培养的细胞 应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状 结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体 而不能将之与体内的细胞完全等同 提示 三 常用术语 初代培养 原代培养 primaryculture 从直接取自生物体细胞 组织或器官开
7、始的培养 初代培养物一旦进行传代培养后 就成为细胞系 通常10代以内的培养物用作原代培养 有限细胞系 finitecellline 生存期有限的细胞系 不能继续传代或传代数有限 连续细胞系或无限细胞系 infinitecellline 获无限繁殖能力能持续生存的细胞系 能连续传代 传代培养 sub culture 不论是否稀释 在体外培养条件下 将细胞从一个培养器皿转移至另一培养器皿 贴壁培养 anchorage dependentculture 细胞或培养物只有贴附于不起化学作用的物体 玻璃或塑料等无活性物体 的表面时才能生长 生存或维持功能 不能表明细胞属于正常或恶性转化 悬浮培养 sus
8、pensionculture 细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式 淋巴细胞 血液肿瘤细胞等 细胞株 cellstrain 通过筛选或克隆化从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的细胞 这些特性 有一定的标记染色体 特殊的抗原性等 在以后的培养中必须持续存在 有限细胞株 finitecellline 生存期有限的细胞株 不能继续传代或传代数有限 连续细胞株或无限细胞株 infinitecellline 已获无限繁殖能力能持续生存的细胞株 能连续传代 亚株 substrain 由原细胞株进一步分离培养出与原株性状有一定不同的细胞群 二倍体细胞系或株细胞群染色体数目具有与原
9、供体二倍体细胞染色体数相同或基本相同 2n细胞占75 以上 的细胞群 在正常情况下具有限生命期 属有限细胞系 随供体年龄和组织来源的不同 寿命长短各异 人胚肺成纤维细胞可传40 60代 人胚肾细胞只有8 10代 人胚神经胶质细胞15 30代为保持二倍体细胞能长期被利用 一般在初代或2 5代即大量冻存作为原种 stockcells 用时再进行繁殖 用后再继续冻存 可供长期使用或延缓细胞的衰老 假二倍体 仅数目相同 而核型不同 即染色体形态有改变者 遗传缺陷细胞系或株从有先天遗传缺陷者取材 主要为成纤维细胞 培养的细胞 或用人工方法诱发突变的细胞 都属遗传缺陷细胞 这类细胞可能具有二倍体核型 也可
10、呈异倍体 肿瘤细胞系或株是现有细胞系或细胞株中最多的一类 我国已建细胞系主要为这类细胞 肿瘤细胞系由癌瘤建成 多呈类上皮型细胞 常已传几十代或百代以上 并具有不死性和异体接种致瘤性 细胞凋亡 apoptosis 细胞内死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程 与机体正常发育 形态形成 消除多余细胞等生理过程密切相关 主要形态特征为细胞皱缩 染色质聚集与周边化 以及凋亡小体的形成 ATCC Americantypeculturecollection 美国模式培养物收集中心 美国菌种保藏中心 除收集细菌 病毒外 还保藏有大量的细胞株 系 体外转化 invitrotransformation 细胞在体外培
11、养过程中发生与原代细胞形态 抗原 增殖或其它特性的可遗传的变化 但不具有致瘤性 汇合 confluence 在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层 细胞融合 cellfusion 在体外培养条件下 经化学试剂 PEG 病毒 灭活仙台病毒 或物理方法 电脉冲 诱发 使不同种的体细胞融合产生杂交细胞 细胞周期 cellcycle 细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程 DNA合成期 S期 有丝分裂期 M期 有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期 G1期 DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期 G2期 群体倍增时间 populationdoublingtime 在对数生长期进行计算的细胞增加一
12、倍所需的时间 细胞代时 cellgenerationtime 单个细胞两次连续分裂的时间间隔 群体密度 populationdensity 培养器皿内 每单位面积或体积中的细胞数 多用细胞数 cm2表示 接触抑制 contactinhibition 当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞表面相互接触时 便停止了分裂增殖 虽然相互紧密接触 但不形成交叉重叠生长 也不再进入S期 饱和密度 saturationdensity 在特定条件下 培养皿内能达到的最高细胞数 当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖 贴壁培养 细胞数 cm2 悬浮培养 细胞数 cm3 分子生物学 生物工程 临床诊断和治疗
13、 生物制品 药物开发 四 细胞培养的现实意义 单克隆抗体制备过程 多莉 克隆猴 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称 细胞的命名无严格统一规定 大多采用有一定意义缩写字或代号表示 但不论什么形式 均不宜太长 以便记忆和了解HeLa 为供体患者的性名 来源于宫颈癌 CHO 中国地鼠卵巢细胞 ChineseHamsterOvary 宫 743 宫颈癌上皮细胞 1974年3月建立NIH3T3 美国国立卫生研究所 NationalInstituteofHealth 建立 每3天传代一次 每次接种3 106cell ml 五 细胞系或细胞株的命名 已建立细胞系或株的签定 管理和使用 培养简历 组
14、织来源日期 物种 组织起源 性别 年龄 供体正常或异常健康状态 细胞已传代数等 冻存液 培养基和防冻液名称 细胞活力 融解前后细胞接种存活率和生长特性 培养液 培养基种类和名称 一般要求不含抗生素 血清来源和含量 ATCC Americantypeculturecollection 入库细胞要求检测项目如下 已建立细胞系或株的签定 管理和使用 细胞形态 类型 如为上皮或成纤维细胞等 核型 二倍体或多倍体 标记染色体的有无 无污染测验 包括细菌 真菌 支原体 原虫和病毒等 物种检测 检测同功酶 主要为G6PD和LDH 以证明细胞有否交叉污染 免疫检测 一两种血清学检测 细胞建立者 建立者性名 检测者姓名 有标准化的工作方法培养用的液体极多 如培养液 胰蛋白酶 HANKS液及抗菌素等 应由专人负责 并保证做到按规程行事 配制浓度准确 灭菌可靠 所有配好的溶液瓶上都要标明名称 浓度 消毒与否和制备日期等 一切培养用品都要有固定的存放点 避免杂乱无章 其中尤其重要的是 培养用品与非培养用品应严格分开 已消毒品与未消毒品应分别存放 细胞培养的工作原则
