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1、Waters液相色谱维护保养 以下课件是我在使用 操作 高效液相色谱仪十年中积累的经验 以及集合外部学习的经验所写 如有讲的不好 错误之处 请大家及时指出 我们共同学习 质检 Waters高效液相色谱常见故障与解析 第一部分常用术语第二部简述HPLC的组成第三部分主要讲液相常见故障与解析 第四部分简谈示差检测的原理第五部分 色谱柱的维护与保养 第一部分术语 1 液相色谱法 就是用液体作为流动相的色谱法 2 固定相 在色谱法中 静止不动的一相 固体或液体 称为固定相3 流动相 能运动的一相 一般是气体或液体 称为流动相4 色谱图 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图 纵坐标为信
2、号强度 通常我们所说的样品浓度 横坐标为保留时间 5 基线 在无组分通过色谱柱时 检测器的噪音随时间变化而产生的曲线 术语 6 基线噪声 没有溶质通过检测器时 检测器输出信号的随机扰动变化 就是没有打进样品而直接查看基线时所产生的杂峰 7 基线漂移 基线随时间的增加朝单一方向的偏离称为漂移 反映的是信号连续的递增和递减 产生原因 电源电压不稳 色谱系统未达到平衡 固定相流失 流动相的变化 温度和流量的波动 术语 8 色谱峰 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 9 峰底 峰的起点与终点间的直线10 峰高 在峰的两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 11 半峰宽 W1 2 通
3、过峰高的中点做平行与峰底的直线 与其峰两侧相交两点间的距离 12 峰面积 A 峰与峰底间的面积 又称作响应值 13 拖尾峰 后沿较前沿平缓的不对称峰 14 前伸峰 前沿较后沿平缓的不对称峰 术语 15 死时间 t0 不被固定相滞留的组分 从进样到出峰最大之所需的时间16 保留时间 tR 组分从进样到出峰最大之所需的时间 17 死体积 V0 不被固定相滞留的组分 从进样到出峰最大之所需的流动相的体积18 柱外体积 从进样系统到检测器之间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的体积 19 淋洗体积 从进样开始计算的通过色谱柱的实际淋洗体积 术语 20 反相色谱柱反相色谱填料常是以硅胶为基础 表面键合有
4、极性相对较弱的官能团的键合相 反相色谱所使用的流动相极性较强 通常为水 缓冲液与甲醇 已腈等混合物 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出 而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留 常用的反相填料有C18 ODS C8 MOS C4 B 术语 21 排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱 是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同 以使组分分离 它类似于分子筛的作用 按分子大小进行分离 试样进入色谱柱后 随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过 在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻 因此就直接通过柱子 首先在色谱图上出现 一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中 这些组分
5、在柱上的保留值最大 在色谱图上最后出现 例如 我们常用的ks 802色谱柱 第一部分术语 22 面积归一法 将所有峰的面积总和定为1 测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积 计算各峰面积占总峰面积的百分率 是包含水分在内的一个计算结果 第一大部分术语 23 面积外标法 外表法就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度做一条标准曲线 测出样品的峰面积或峰高 在标准曲线上查出其对应的浓度 这是最常用的一种定量方法通过进标样建立一个校正曲线 一般是6针标样 校正曲线的横坐标是标样的浓度 含量 纵坐标是峰面积 校正曲线就相当于 Y aX b的公式 校正曲线建立好后样品的峰面积带入方程就可以得
6、到相应的浓度 含量 输液系统泵以及流动相 进样系统进样阀 分离系统 色谱柱 检测系统 11 第二部分HPLC的组成 数据处理系统 Waters515泵 输液系统 输 13 输出流量恒定 压力平稳 足够的动力 高压输液泵 Waters2414示差检测器 15 检测系统 进样系统 16 手动进样 数据处理系统 N2000色谱工作站 18 第三部分液相常见故障及解决方案 19 从泵的压力变化推测 A 泵内没有压力显示 没有流动相流动 20 从压力变化推测 A 没有压力显示 没有流动相流动 21 B 流动相流动正常 但没有压力显示 B 泵内有液流出 但使没有压力显示 22 C 压力高 堵 23 D 压
7、力低 漏 24 H 压力波动 E 压力波动 25 从色谱图的异常情况推测 A 基线漂移 26 B 基线噪声 气泡 污染 27 C 保留时间变化 柱压 流速 如何判断入口单向阀是否正常的简易方法 在泵运行过程中将溶剂吸滤头从流动相中拿出 放进一小段气泡进入溶剂管路 进行观察 样品处理 使用流动相溶解样品 保证样品的溶解度 减少溶剂峰 进样前使用0 45um或更小的膜进行过滤 手动进样 应使用液相色谱专用平头进样针吸液至少大于5 10倍定量环体积转动阀芯时不能太慢 更不能停留在中间位置 29 进样的注意事项 2414示差检测器原理 示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样
8、品含量的 光从一种介质进入另一种介质时 由于两种物质的折射率不同就会产生折射 只要样品组分与流动相的折光指数不同 就可被检测 二者相差愈大 灵敏度愈高 在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比 示差折光检测器原理 检测器的光路是由光源 凸镜 检测池 反射镜 平板玻璃 双光敏电阻等主要部件组成 检测池有参比 测量两个池室 它们对光路来说是串联的 示差检测器原理 第四部分色谱柱的维护与保养 1 钙柱 此色谱柱由钙基树脂填装而成 氢离子或其它离子会取代钙离子 或是引起与柱中糖的转换 尤其是像蔗糖这样易于转换的糖 因此推荐在流动相中加入一定量的钙离子不保持平衡和防止与样品的转换 要保持装流动相的瓶
9、子干净 有盖子 且新鲜 流动相需要每24小时重新配制 新的钙柱使用注意事项 2新色谱柱的使用 为了保证新柱子能在分析使用之前得到足够的钙离子的平衡1 将柱子按照通常使用的反方向安装 标签上的箭头指向柱子的入端口 2 用至少100ml的0 001MEDTA钙盐溶液在90 用0 5ml min流速反冲柱子 500mg L的钙盐的浓度大约为0 001M 3 将柱子反过来 回到通常的流动方向 用分析所用流动相冲柱子 用与上一上步骤同样的条件 直到基线平稳方可使用 钙柱再生的时间 3 柱子再生的时间 根据相关的样品含有较多重金属和过渡金属元素或是有机酸的样品越是需要经常地对柱子进行再生 因为它们会与柱子
10、发生转换 检测是否需要再生可以通过注射蔗糖来测试柱子的置换 如果蔗糖的峰有明显拖尾 那么柱子需要做以下处理 第四部分色谱柱的维护与保养 4柱子的再生步骤 1 配制500ml的再生溶液 500mgEDTA Ca L2 把柱子流路方向反过来 在90 下以0 5ml min的流速冲洗一整夜 3 再生之后回到正常方向使用 当柱子反冲时 很重要的一点是需要保持溶剂的温度从而确保正确的冲洗 用冷的溶剂将会延缓冲洗的过程 使用钙柱注意的事项 5 通常推荐压力不超过2000psi 最大流速不超过0 6ml min 70 不要在流动相中使用氯化钙 硝酸钙以及其它强酸的钙盐 这样会腐蚀柱子 破坏填料 柱子的温度不
11、要超过95 通常高温会带来高的分辨率 但在90 95 之间几乎没有变化 70 以下对许多糖的异构体的分离不能提供足够的分离度 对于乙醇的定量 柱温应在75 KS 802钠型柱新色谱柱 钠型柱以ks802柱子为代表 1 新色谱柱的使用 为了保证新柱子能在分析使用之前要得到足够的钠离子的平衡1 将柱子按照通常使用的反方向安装 标签上的箭头指向柱子的入端口 2 用至少100ml的0 002MNAOH溶液在50 用0 2ml min流速反冲柱子 4h以上 3 将柱子反过来 回到通常的流动方向 用分析所用流动相冲即无二氧化碳的纯水冲洗柱子 用与上一上步骤同样的条件 直到基线平稳方可使用 KS 802色谱
12、柱再生的时间 柱子再生的时间 根据相关的样品含有较多重金属和过渡金属元素或是有机酸的样品越是需要经常地对柱子进行再生 因为它们会与柱子发生转换 检测是否需要再生可以根据注入木糖标样或进行测试柱效时用到的2 5 乙二醇来检测 如有明显拖尾或者柱子理论踏板明显降低那么柱子需要做以下处理 KS 802色谱柱的再生 柱子的再生步骤 1 配制500ml的再生溶液 0 2mol LNAOH溶液2 把柱子流路方向反过来 在35 0 2ml min的流速冲洗一整夜 3 特别注意用水冲洗系统的时候 一定先把砂芯过滤头先放入纯水超声 冲洗至ph中性为止 然后再生之后回到正常方向 用无二氧化碳的纯水同样的条件冲洗至ph中性为止 使用钠型柱时注意事项 通常推荐压力不超过600psi 最大流速不超过1 0ml min 80 进样前一定要把样品过滤 然后再进样 禁止进样强酸的样品 这样会腐蚀柱子 破坏填料 晚上不测样品时一定要把柱子的温度降至40 以下 流速0 2ml min如果只降流速不降温 那么很不幸的告诉你 你的色谱柱填料会在很短的时间内被烤至塌陷 分离度降级 报废 经验 如果色谱柱再生后 把它放入冰箱冷藏一段时间 然后再使用会起到意想不到的效果 谢谢
