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1、基因工程抗体 2 1888年Roux Yersin白喉外毒素1890年Behring Kitasato抗毒素 血清疗法1939年Tiselius Kabatg globulin1959年PorterFab Fc1962年EdelmanH L1962年PorterFab H L Fc H 1975年Kohler MilsteinMcAb1980年TonegawaAbdiversity1984年SharonEngineeringantibody1989年Winter LernerAntibodyLibraries 3 EmilvonBehring 1901 antitoxins GeoregesK
2、ohlerandCesarMilstein 1984 monoclonalantibody SusumuTonegama 1987 structureofIggene GeraldEdelmanandRodneyPorter 1972 structureofantibody PaulEhrlich 1908 productionofantibody NobelPrizewinners 4 5 6 7 NatureMedicine2012年报道 根据ThomsonReutersPharma的预测 2012年销售前十位的药物中抗体占7个 抗体开创未来 8 9 10 11 12 13 14 15 1
3、6 抗体的发展 抗血清的制备 19世纪末 Behring单克隆抗体 1975 Koehler和MilsteinNature1975Aug7 256 5517 495 7Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity 基因工程抗体 1984 SharonNature1984May24 30 309 5966 364 7ExpressionofaVHCkappachimaericproteininmousemyelomacells 17 抗血清 多克隆抗体 的制备 Foreignproteins Viru
4、ses Bacteria Parasites Fungi Antigens Bcell Bcellactivated Humoralresponse Plasmacellssecreteantibodies THcell Antigen Vertebratebody 18 多克隆抗血清 对健康人用疫苗进行主动免疫 免疫前 a 和免疫后10天 b 分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析 免疫前血清中的 球蛋白条带较宽 免疫之后则相对集中 Bruton氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失 c 19 小鼠体系 半衰期短 HAMA大鼠体系 单抗腹水比小鼠高10倍 易亲合层析人体系 人 鼠杂交瘤 人 人杂
5、交瘤 单克隆抗体的制备 20 21 杂交瘤细胞的选择性培养 DNA合成的途径 氨基喋呤 Aminopterin A 糖 氨基酸 核苷酸 胸腺嘧啶核苷 Thymidine T TK TMP 次黄嘌呤 IMP HGPRT 核苷酸前体 DNA Hypoxanthine H 22 融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞 HGPRT 不能长期生长 骨髓瘤细胞 HGPRT 不能生长 23 蛇毒单抗的制备 24 25 鼠源单克隆抗体的应用 基础研究 细胞抗原研究及鉴定分类 细胞受体研究 分子克隆及功能研究 医学研究及诊断 感染性疾病诊断 肿瘤诊断及预后判断 其它诊断及研究 不足 半衰期短 人抗鼠抗体反应
6、HAMA 26 将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术结合起来 对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新组装 转染适当的受体细胞后表达出抗体分子 这种经基因重组的抗体称为基因工程抗体 基因工程抗体 概念 27 1 从杂交瘤或免疫脾细胞 外周血淋巴细胞等提取mRNA逆转录成cDNA2 PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因3 构建表达载体4 在适当的宿主细胞中表达并折叠成有功能的抗体分子5 筛选出高表达细胞株6 亲和层折等手段纯化抗体片段 基因工程抗体 基本原理 28 基因工程抗体 人源化 Humanization 抗体 29 Humanization Chime
7、ric ReshapedAntibody Constantregion Fc Mouseantibody Antigen bindingregion Fab Antigen bindingregionsfrommouse Specifivantigen bindingsitesfrommouse Chimericantibody 66 Fullyhuamnantibody 100 Humanizedantibody 90 30 FR 为CDR的构象提供环境 参与抗体结合位点正确构象的形成 简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的亲和力方法 模板替换较大同源性人FR替换鼠FR表面重塑对鼠CDR及
8、FR表面残基镶饰或重饰 类似人补偿变换CDR移植后更换部分的人FR 鼠定位保留以人FR保守序列为模板进行人源化 人源化抗体的构建策略 31 从同源抗体或抗体的共同序列中选择人源FR确定在FR中起关键作用的氨基酸以鼠单抗可变区的立体模型作指导 人源化抗体的构建策略 关键 目标 保持抗体的亲和力降低免疫原性 32 从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性V区基因 并与人抗体C区基因按一定的方式重组 克隆到表达载体中构建鼠 人嵌合的轻重链基因表达载体 再转入宿主细胞表达 经筛选后制备成特异性的嵌合抗体 人 鼠嵌合抗体 概念 33 PCR 鼠抗体基因 人抗体基因 VLCL VHCH
9、1CH2CH3 VLCL VHCH1CH2CH3 嵌合轻链 嵌合重链 IgG 34 人 鼠嵌合抗体 特点 完全保留鼠单抗的特异性和亲和力 降低了HAMA不良反应 一定的免疫原性 V区完全鼠源性 35 改型抗体 抗体分子轻 重链可变区的6个CDR形成CDR平面直接接触抗原 决定了抗体的特异性 骨架区只是作为支持CDR襻的支架 而且其立体构象极为保守 因此 将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区上 有可能使人单抗获得鼠单抗的特异性 并最大限度地减少鼠单抗的异源性 仅有9 的序列来源于亲本鼠单抗 这种CDR移植的人单抗称为改型抗体 36 CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体 改型抗
10、体 鼠单克隆V区人源化 CDR移植 37 治疗性抗体的开发几经反复终于形成蓬勃发展 鼠单抗人源化的技术功不可没 鼠单抗人源化时基本选择IgG同种型 在体内IgG与存在于内皮细胞表面的受体FcRn相互作用 在细胞内受到保护不被降解而具有较长的半衰期 同时鼠IgG通过激活补体和结合Fc受体激发一系列生物效应功能的效率较低 无论是嵌合抗体还是改型抗体均通过使用人恒定区克服了这一缺陷 人源化抗体的评价 38 对于人源化的最主要的初衷 消除异源性的评价却要复杂的多 除了降低抗体分子的鼠源序列外 其免疫原性还受到其它因素如给予抗体的途径和剂量 病人的病情和免疫状况 抗体所针对的抗原的特性和部位以及抗体本身
11、激活生物学效应的特性等均相关 因此应该综合考虑 人源化抗体的评价 39 不同种属之间抗体分子可变区的差别远低于恒定区的差别 构建改型抗体要比构建嵌合抗体的工作量大的多 还常常导致亲和力不同程度的降低 付出亲和力和增加研制成本的代价是否值得的问题 人源化抗体的评价 改型抗体相对于嵌合抗体的优越性存在质疑 40 应当制备配对的改型和嵌合抗体 用于足够量的可比较的人群 观察其诱发抗抗体的生成情况 这是难以做到的 迄今大量临床应用的情况揭示其他影响免疫原性的因素值得重视 因此一味追求序列的同源性而摒弃嵌合抗体是值得商榷的 事实上即使完全人源化的抗体也可以诱发抗独特型抗体 并不可能完全消除治疗性抗体的免
12、疫原性 而这种抗独特型反应的后果如何待进一步观察 人源化抗体的评价 欲确切评判人源化对免疫原性的影响 41 V区片断 1 3 1 80 具有与抗原结合的功能种类 Fab抗体单链抗体 ScFv Fv片断抗体单域抗体SDAb最小识别单位MRU 小分子抗体 42 1 小分子抗体 43 组成 由重链V区及CH1功能区与轻链二硫键连接 50KD 为完整IgG的1 3 应用前景 较好的渗透性和药代动力学特征HAMA反应存在亲和力较低 稳定性差 Fab抗体 44 免疫球蛋白基因载体的构建 H链表达载体 L链表达载体 共转染细胞 PrVHCH1PrVLCL Fab抗体分子的制备 Fab抗体 45 抗体分泌细胞
13、 VH VL CL S S CH1 Fab抗体分子的制备 Fab抗体 46 单链抗体 ScFv 组成 特点 VH和VL通过连接肽重组表达 分子量小 穿透力强 体内循环半衰期短 免疫原性低可作为其它抗体的基本元件 47 单链抗体基因的构建一般采用从杂交瘤细胞提取mRNA 反转录成cDNA 通过PCR扩增其VL及VH基因 再用人工合成的寡核苷酸序列即接头把VL的C端与VH的N端或VH的C端与VL的N端连接 即成单链抗体基因 单链抗体 ScFv 构建方法 48 VHVL 接头DNA Gly4Ser 3 VH引物 PCR VH接头DNA 酶切 克隆 ScFv singlechainFv scFv 的构
14、建 变性 复性 VL引物 VL 单链抗体 ScFv 49 单链ScFv 抗原含重复抗原决定簇时 亲和力下降8倍以上双价ScFv 改善ScFv的亲和活性双特异性ScFv 与细胞因子IL 2 TNF相连 特异性杀伤 应用前景 50 保持抗体的可溶性接头 长度 V区空间结构 组成 单域抗体 一个VH或VL功能结构域 特点 分子量小Ig分子的1 12 抗原性弱 穿透力强抗原性弱 相对较粘 疏水面的暴露有关 在全抗体分子中 疏水面被VL遮盖 细菌LPS的单域抗体在杂交瘤细胞中的表达量比亲本单克隆抗体高50倍以上 设计原则 51 最小识别单位 minimalrecognitionunit MRU 组成 高
15、多变区多肽 hypervariableregionpolypeptides HRP 一个CDR多肽 特点 设计原理 应用 16 30氨基酸 抗原性弱 穿透力强非特异性吸附 每个CDR的作用不同寻找在抗原识别和亲和力方面有重要意义的CDR 抗血小板纤维蛋白原受体CDR3 抑制纤维蛋白原 PACI与血小板的结合 52 传统单抗分子量大 穿透力弱基因工程小分子抗体穿透力强 亲和力低 多价微型抗体双链抗体 diabody 双特异性抗体 bispecificantibody 微型抗体 minibody 三链抗体 triabody 四链抗体 tetrabody 多价微型抗体 53 VL VH CH380k
16、D易于构建及生产血中停留时间长靶部位吸收好 CH3 dimerizedscFV 微型抗体 54 LD型LD LEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG Flex型连接肽序列 CH3 55 价肽取决于连接肽段所形成的聚合物特性 多价ScFv与单价ScFv和Fab片断相比 与靶抗原结合的功能亲和力提高 四链抗体 4helix stabilizedscFvtetramers 56 Leucine zipperstabilizedscFvdimers Helix stabilizedscFvdimers 4helix stabilizedscFvtetramers Streptavidin scFv scFvfusionswithdi andmultimeriaztiondomains 57 双链抗体的分子量为60KD左右 三链抗体为90KD左右 二者均显著大于ScFv单体的分子量 约30KD 因而在体内应用多价微抗时 可以降低抗体在循环中的清除速度 但这种优势也可能因穿透能力的降低而抵消 双链抗体和三链抗体的较短接头不易被蛋白酶水解 而单价ScFv的较长接头却易被水解 多价ScFv与
