《试验四-人毛囊DNA的快速提取及PCR检测性别M讲课教案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《试验四-人毛囊DNA的快速提取及PCR检测性别M讲课教案（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验四人毛囊DNA的快速提取及PCR方法检测SRY基因判断性别 实验目的 掌握毛囊DNA的快速提取方法及其原理掌握DNA的电泳检测技术学习PCR扩增DNA的原理 掌握PCR操作步骤掌握利用PCR技术扩增SRY基因判断性别的原理 前期准备 前期处理 挑出毛发10根 尽量剪短至只剩下毛囊 去除毛根 放入干净的EP管中 加入PH8 0的灭菌水清洗1 2次 离心后吸出水 PCR扩增进行性别鉴定 PCR试验原理聚合酶链式反应 polymerasechainreaction PCR 是当今现代分子生物学的三大主流技术之一 PCR扩增产物检测 用浓度为1 2 的琼脂糖凝胶对PCR产物 DNA 进行电泳分离
2、琼脂糖凝胶中有很多小孔隙 起一个分子筛的作用 DNA在电场的作用下由负极往正极移动穿过这些孔隙 DNA迁移速率与电场强度成正比 与DNA分子量大小成反比 从而将大小不同的DNA片段分离开来 SRYPCR产物大小 501bpGAPDHPCR产物大小 565bp PCR扩增体系 10ul总体系 H2O7 10 70Buffer1 010Primer F0 33Primer R0 33dNTP0 33Taq0 11Template 毛囊DNA 1 0ul PCR扩增程序 95 4min 94 30s 60 30s 72 30s Goto230循环72 5min 4 5min 方法一酚仿抽提法 试剂
3、10 SDS 蛋白酶K 20mg ml 苯酚 氯仿 异戊醇 乙醇TE10mmol LTris Hcl PH 8 0 1mmol LEDTA PH 8 0步骤 酚仿抽提法 优缺点 该方法提取的DNA浓度不是很高 中间步骤过多会损失大量的DNA 所以如果是很细小的毛 并且量不多 不建议使用此方法 但是此方法提取的DNA质量较好 扩增效果好 酚仿抽提法 图1 酚仿抽提法检测结果 方法二 碱裂解法 于装有毛囊的EP管中加入0 2mol L的NaOH溶液50 L 煮沸15min后 瞬时离心 吸取上清液至另外一只干净的离心管中加入PH 6左右的Tris HCl50 L 13000r离心2min将上清液转移
4、到另外一只EP管中即可 方法二 碱裂解法 优缺点 该方法提取步骤较简单 提取周期短 并且DNA损失量较少 提取效率高 但PH值不容易调节以至于会影响到后续PCR扩增 因此如果PCR扩增效率不高的引物 不建议用该方法提取 方法三 PCR扩增法 试剂 10 PCR缓冲液 Mg2 蛋白酶K 20mg ml 实验步骤 按以下体系配制毛囊裂解液 10 PCR缓冲液100 LMg2 80 L蛋白酶K 20mg ml 1 LddH2O819 L 方法三 PCR扩增法 加入上述裂解液15 L于放有毛囊的EP管中在PCR仪上设置一个单循环程序 65 30min 95 15min 4 10min 将上一步骤中的P
5、CR试管放入预热好的PCR仪中 运行该程序 吸取上清液于干净的EP管中即可 方法三 PCR扩增法 优缺点 该方法提取DNA的效率较高 可获得较多的DNA 并且需要的毛囊量较少 较细且少量的毛囊建议用此方法提取DNA 但是该方法抽提的DNA质量不是很好 扩增的时候需加大DNA加入量 并且扩增的结果中可能会有大量杂带 图2 PCR法抽提检测结果 电泳检测 制备1 的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA具有结合EB分子的能力 在紫外灯下产生荧光的信号 二PCR扩增进行性别鉴定 性别鉴定原理人类男性的性染色体组成是XY 女性的性染色体组成是XX 因而通过对一些在Y染色体上所特有的基因 如SRY基因 进行PCR扩增分析 即可对性别进行鉴定 本试验通过对毛囊DNA中的SRY基因进行PCR扩增分析进行性别鉴定 扩增呈阳性的为男性 扩增呈阴性的为女性 同时以常染色体上的GAPDH基因为阳性对照 男女皆能扩增出产物 人类SRY基因的序列 用于性别鉴定扩增的引物序列 扩增退火温度 60 C
