《高二生物1基因工程人教实验知识精讲.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高二生物1基因工程人教实验知识精讲.doc（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高二生物专题1 基因工程人教实验版【本讲教育信息】一. 教学内容：专题1 基因工程1.1 DNA重组技术的基本工具（一）教学内容理解DNA重组技术所需三种基本工具的作用，认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新（二）教学重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用（三）教学难点：基因工程载体需要具备的条件（四）教学过程： 1. 基因工程的原理基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在水平上进行设计和施工的，因此又叫做。2. 限制性核酸内切酶限制酶“分子手术刀”掌握限制酶的作用，切割后产生
2、的结果，关注限制酶从哪里寻找？噬菌体侵染细菌的实验单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？ 在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。限制酶是基因工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶。A. 限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 48 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表23）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可
3、识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。4 个碱基识别位点：Sau3AGATC5 个碱基识别位点：EcoR CCWGG 6 个碱基识别位点：EcoR GAATTC 7 个碱基识别位点：BbvC CCTCAGC8 个碱基识别位点：Not GCGGCCGC B. 限制酶切割的位置限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3A（GATC）、Nla（CATG）和 EcoR（CCWGG） 等；在两侧的有 Bc
4、g（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）和 TspR（CASTGNN）， Bcg 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvGCAGC（8/12） 和 BspMACCTGC（4/8） 等。C. 限制酶产生的末端（1）限制酶产生匹配粘端（matched ends）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性 末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5 突出粘性末端，如 EcoR ；若在 3侧切割
5、，则产生 3 突出粘性末端，如 Kpn 。（2）限制酶产生平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 Hae（GGCC）和 EcoRV（GATATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。（3）限制酶产生非对称突出端许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvC ，它的识别切割位点如下。 CCTCAGC GGAGTCG有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 Acc ，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称。
6、GTAT/CGAC CATA/GCTG有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 Dra 和 Ear（1）切割DNA的工具是，又称。（2）这类酶在生物体内能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保持细胞原有的遗传信息。（3）由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶（简称限制酶）。（4）DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段，末端通常有两种形式，即和。例1 下列关于限制酶的说法正确的是（ ）A. 限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B. 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C. 不同的限制酶切割D
7、NA后都会形成黏性末端D. 限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键答案：B3. DNA连接酶DNA连接酶DNA片段的“分子缝合针”，连接被切割开的DNA，与“DNA聚合酶”的区别是什么？根据DNA连接酶的来源不同，可以将它分为两类：大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD（而不是ATP）反应形成酶AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶
8、催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNADNA，DNARNA，RNARNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。一类是从大肠杆菌中分离得到的，称
9、为DNA连接酶。DNA连接酶只能将连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。另一类是从分离出来的，称为T4DNA连接酶。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的，又可以“缝合”双链DNA片段的，但连接之间的效率比较低。例2 下图为DNA分子的切割和连接过程。（1）EcoRI是一种酶，其识别序列是，切割位点是与之间的键。切割结果产生的DNA片段末端形式为。（2）不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是连接酶，此酶的作用是在与之间形成键，而起“缝合”作用的。还有一种连接平末端的连接酶是。答案：限制酶 GAATTC 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌吟脱氧核苷酸 磷酸二酯键 黏性末端 DNA
10、 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌吟脱氧核苷酸 磷酸二酯键 T4DNA连接酶4. 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车”，记住这几个条件，明确为什么要有这四个条件才能充当载体？在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DN
11、A（一般有1200 kb左右，kb为千碱基对），有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。（1）基因操作过程中使用载体两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。（2）现在通常使用的载体是，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核DNA之外的环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个。（3）质粒通
12、过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以复制，也可整合细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。（4）其他载体还有和等。（5）作为载体必须具备以下条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接具有某些标记基因，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。例3 以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，分析回答问题。（1）其中和是由一种限制酶切割形成的末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是。（2）和是由另一种限制酶切割形成的末端，两者要形成重组DNA片段，所用DNA连接酶通常是。 答案： 平 T4DNA连接酶 黏性 DNA
13、连接酶【模拟试题】1. 关于限制酶的说法中，正确的是（ ）A. 限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B. EcoRI切割的是GA之间的氢键C. 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD. 限制酶只存在于原核生物中2. DNA连接酶催化的反应是（ ）A. DNA复制时母链与子链之间形成氢键 B. 黏性末端碱基之间形成氢键C. 两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接 D. A、B、C都不正确3. 作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是（ ）A. 能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B. 具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C. 具有某些标记
14、基因，以便为目的基因的表达提供条件D. 能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选4. 质粒是基因工程最常见的载体，它的主要特点是（ ） 能自主复制 不能自主复制 结构很小 是蛋白质 是环状RNA 是环状DNA 能“友好”地“借居”A. B. C. D. 5. 在受体细胞中能检测出目的基因是因为（ ）A. 目的基因上有标记 B. 质粒具有某些标记基因 C. 重组质粒能够复制 D. 以上都不正确6. 关于质粒的叙述正确的是（ ）A. 质粒是能够自我复制的环状DNA分子 B. 质粒是唯一的载体C. 重组质粒是目的基因 D. 质粒可在宿主外单独复制7. 基因工程中可用作载体的是（ ） 质粒 噬菌体 病毒 动物细胞核
