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1、 药物分析PharmaceuticalAnalysis 主讲 王庆 第四章药物的含量测定方法与验证 教学目的与要求 掌握定量分析样品前处理方法 掌握定量分析方法特点 掌握滴定度与含量计算 掌握药品质量标准分析方法验证 熟悉样品分析前处理方法的适用范围 不同分析方法对验证内容的基本要求 教学重点与难点 定量分析方法及其特点 药品分析方法的验证 基本要求 前言 药物的含量 指药物中所含主成分的量 是评价药物质量的重要指标 前言 药物的含量测定 分两类 基于化学或物理学原理的含量测定 基于生物学原理的效价测定 目标 基础 本章的目标 含量测定 生物检定法 微生物检定法 酶法 P40 效价测定方法 凡
2、以生物学方法或者酶学方法对药品中的特定成分以标准品为对照 作量反应平行线测定方法进行的生物活性 效力 测定 前言 药物的含量测定 第一节定量分析方法的分类与特点 一 容量分析法 亦称滴定法定义 将已知浓度的滴定液 标准物质溶液 由滴定管滴加到被测药物的溶液中 直至滴定液与被测药物反应完全 通过适当方法指示 然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积 按化学计量关系计算出被测药物的含量 通过指示剂颜色变化 或者电子设备的电位或电流突变来指示滴定终点 滴定终点和计量不一致 就会引入滴定误差 应该尽量避免 一 容量分析法 特点 1 方法简便易行 所用仪器价廉易得 操作简便快速 2 方法耐用性高 影响测定的试
3、验条件与环境因素少 3 测定结果准确 误差低于0 2 满足准确度高样品 4 方法专属性差 对相近杂质干扰缺少选择 适用于主成分含量较高的样品分析 适用范围 广泛应用于化学原料的测定 较少应用于药物制剂的测定 二 容量分析法的有关计算 滴定度 每1mL规定浓度的滴定液所相当的被测药物质量 中国药典 用毫克 mg 表示 二 容量分析法的有关计算 滴定度的计算 被测药物 滴定液 用B滴定A 被测药物反应的质量 滴定液反应的质量 滴定液的摩尔质量 被测药物的摩尔质量 二 容量分析法的有关计算 滴定度的计算 用B滴定A 滴定液 待测液 浓度乘体积 nB 浓度mB 等于1mL 计算有一个从质量到物质的量
4、再到浓度再到滴定度的转变过程 示例一计算Vc的滴定度T碘量法测定Vc含量 M C6H6O6 176 13 C I2 0 05mol L 二 容量分析法的有关计算 示例二异烟肼的滴定度溴酸钾法测定异烟肼含量 M C6H7N3O 137 14 C溴酸钾 0 01667mol L 二 容量分析法的有关计算 二 容量分析法的有关计算 3 含量计算方法 直接滴定法与间接滴定法直接滴定法 在实际工作中 滴定液的浓度可能与药典规定的浓度并不一致 所以应该进行校正 二 容量分析法的有关计算 直接滴定法的含量计算方法 自己标定 药典规定 直接读取 取样量 二 容量分析法的有关计算 1 生成物滴定法 1 生成物滴
5、定法 示例三葡萄糖酸锑钠的含量测定 本法先用葡萄糖酸锑钠与碘离子反应生成碘 再用碘与硫代硫酸钠反应生成碘离子 相当于是用硫代硫酸钠在滴定葡萄糖锑钠 因此要找出它们两者的量反应关系 也就是a和b 0 3g供试品 水100mL 盐酸15mL 碘化钾试液10mL 密塞 振摇后暗处放置10min 碘量法 Sb5 2S2O32 1 生成物滴定法 2 剩余量滴定法 2 剩余量滴定法 2 剩余量滴定法 示例四司可巴比妥钠的含量测定取本品约0 1g 精密称定 置250mL碘瓶中 加水10mL 振摇使溶解 精密加溴滴定液 0 05mol L 25mL 再加盐酸5mL 立即密塞 并振摇1min 在暗处放置15mi
6、n后 注意微开瓶塞 加碘化钾试液10mL 立即密塞 摇匀后 用硫代硫酸钠滴定液 0 1mol L 滴定 至终点时 加淀粉指示液 继续滴定至蓝色消失 并将滴定得的结果用空白试验校正 2 剩余量滴定法 2 剩余量滴定法 示例四司可巴比妥钠的含量测定已知 司可巴比妥钠M 260 27 司可巴比妥钠与溴反应摩尔 1 1 W 0 1022g 硫代硫酸钠浓度校正因子 1 038 供试品滴定Vs 15 73mL 空白试验滴定Vo 23 21mL 讨论 在剩余量滴定法中 第一滴定液与第二滴定液的浓度是相当的 如上例中 第一滴定液为溴滴定液 0 05mol L 第二滴定液为硫代硫酸钠滴定液 0 1mol L B
7、r2 I2 2Na2S2O3 本公式适用于空白校正情形 2 剩余量滴定法 本公式适用于没有做空白校正情形 习题一剩余碘量法测定异烟肼含量异烟肼在弱碱性溶液中 加定量过量的碘滴定液 0 1mol L 氧化 反应完成后 酸化 剩余碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液 0 1mol L 滴定 以淀粉为指示剂 二 容量分析法的有关计算 习题二非那西丁含量测定精密称取本品0 3630g加稀盐酸回流1小时后 放冷 用亚硝酸钠液 0 1010mol L 滴定 用去20 00mL 每1mL亚硝酸钠液 0 1mol L 相当于17 92mg的C10H13O2N 请计算非那西丁的含量 二 容量分析法的有关计算 二 光谱分析
8、法 光谱分析法 药典收载 红外分光度法 火焰光度法 紫外可见分光度法 荧光分析法 原子吸收分光光度法 本章讲叙 紫外可见分光度法 荧光分析法 一 紫外 可见分光光度法 基于物质分子对紫外光区 波长为200 400nm 和可见光区 波长为400 760nm 的单色光辐射的吸收特性建立起来的光谱分析方法 1 朗伯 比尔定律 2 方法特点与适用范围 1 简便易行 本法使用的仪器价格比较低廉 操作简单 易于普及 2 灵敏度高 本法灵敏度可达10 7 10 4g mL 适用于低浓度试样分析 3 准确度较高 本法误差在2 5 之间 适用于对测定结果的准确度要求较高的样品 4 专属性较差 本法通常不受一般杂
9、质的干扰 但对结构相近的有关物质缺乏选择性 本法紫外区须选用石英比色皿 比色皿一般为1cm 吸光度在0 3 0 7之间为宜 选用最大吸收光波长 本法比较少应用于原料药的含量测定 可用于制剂的含量测定 一 紫外 可见分光光度法 1 对照品比较法 分别配制供试品溶液和对照品溶液 对照品溶液中所含被测药物的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100 10 所用溶剂量两者相同 在规定的波长下测定吸光度 按下式计算结果 Cx供试品溶液浓度 CR对照品溶液浓度 Ax AR对应吸光度 1 对照品比较法 对原料药 对应于稀释体积浓度 1 对照品比较法 对于固体制剂 P16 制剂的标示量 系指每一支 片或每一个单
10、位制剂中含有主药的重量 或效价 或含量或装量 2 吸收系数法 引入吸光系数的含量计算方法 溶液 片剂 mg转化单位 g mL 2 吸收系数法 示例 盐酸氯丙嗪注射液的含量测定 精密量取本品适量 约相当于盐酸氯丙嗪50mg 置200mL量瓶中 加盐酸溶液 9 1000 稀释至刻度 摇匀 精密量取2mL 置100mL量瓶中 用盐酸 9 1000 稀释至刻度 摇匀 在254nm下测定吸光度 按盐酸氯丙嗪的吸收百分系数计算 即得 注射液 选溶液公式 如下 2 吸收系数法 D为供试品溶液的稀释体积 共稀释了200mL 100 2 10000mL 是注射液规格 mL 支 已知B 注射液标示量 mg 支 已
11、知V 供试品取样量 2mLA 吸光度 测量值 已知 已知 2 吸收系数法 溶液公式推导如下 固体试剂公式推导如下 2 吸收系数法 3 计算分光光度法多种 具体按每种药物规定的方法进行如 VA的三点校正法不宜做含量测定4 比色法加入显色剂后 按照对照品比较法测定影响显色因素很多 故需注意平行操作空白溶剂 溶剂 显色剂 同法处理 一 紫外 可见分光光度法 二 荧光分析法 特点灵敏度高 可达10 10 10 12g mL要求低浓度下测定 防止自熄灭作用干扰因素多 须做空白测定荧光弱的药物可衍生化后测定 可提高灵敏度和选择性 含量测定原理 当激发光强度 波长 所用溶剂及温度等条件固定时 物质在一定浓度
12、范围内 其荧光强度R与该物质浓度C成正比方法 对照品比较法计算 二 荧光分析法 根据混合物中各组分的色谱行为差异 先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法 是分离分析混合物的最有力手段 按分离原理 吸附 分配 离子交换 排阻色谱分类按分离方法 PC TLC 柱色谱 GC HPLC 特点 高灵敏度 高效能 高速度 应用广泛 三 色谱分析法 1 对仪器一般要求固定相种类 流动相组分 检测器类型不得任意改变其他均可适当改变色谱图20分钟内记录完毕2 系统适用性试验色谱柱的理论板数 n 5 54 tR Wh 2 2分离度 R 2 tR1 tR2 W1 W2 应大于1 5重复性 对照液连续进样5
13、次 峰面积RSD 2 0 拖尾因子 T W0 05h 2d1应在0 95 1 05 一 HPLC h W1 2 0 5h 0 607h W 0 t t0 tR 流动相 真空脱气机 四元泵 自动进样器 紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 流动相 对于以C18为固定相的反相色谱系统 常用甲醇 水 间或加以乙腈 缓冲液等为流动相 有机溶剂比例通常不低于5 四元泵 自动进样器 色谱柱 填充剂常用 十八烷基硅烷键合硅胶 检测器 1 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 对照液 R ARCR 峰面积含量 内标液 S ASCS 供试液 X AXCX f AS CS AR CR f A S C S A
14、x Cx Cx f Ax A S C S 3 HPLC测定法 2 外标法测定供试品中主成分含量 对照液 R ARCR 供试液 X AXCX CXCR AXAR CX CR AX AR 要求 进样量准确 操作条件稳定 3 HPLC测定法 3 HPLC测定法 示例一炔诺酮的含量测定照高效液相色谱法 附录VD测定 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 以甲醇 水 65 35 为流动相 检测波长为244nm 理论塔板数按炔诺酮峰计算不低于1500 炔诺酮峰与内标物质峰的分离度及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要求 内标溶液的制备取黄体酮约25mg 精密称定 置25mL量瓶
15、中 加甲醇溶解并稀释至刻度 3 HPLC测定法 示例一炔诺酮的含量测定测定法取本品约25mg 精密称定 置25mL量瓶中 加甲醇溶解并稀释至刻度 摇匀 精密量取此溶液2mL与内标溶液3mL 置10mL量瓶中 加甲醇稀释至刻度 摇匀 取20 L注入液相色谱仪 记录色谱仪 记录色谱图 另取炔诺酮对照品适量 精密称定 同法测定 按内标法以峰面积计算 即得 1 对GC仪器一般要求载气 氮气色谱柱 填充柱或毛细管柱填充柱 内径2 4mm 长1 10m 内装吸附剂高分子多孔小球或涂渍固定液的载体毛细管柱 内径0 2 0 5mm 长10 100m 一般为空心柱 内壁或载体经涂渍或交联固定液 检测器 氢火焰离
16、子化检测器色谱图 30分钟内记录完毕 二 气相色谱法 2 色谱适用性实验 同HPLC3 测定法 同HPLC 二 气相色谱法 示例松节油的含量测定色谱条件与系统适用性试验用聚乙二醇 PEG 20M为固定相 涂布密度为20 柱温为90摄氏度 理论塔板数按 蒎烯峰计算应不低于1500 校正因子测定取正丁醇适量 精密称定 加石油醚 30 60 C 至刻度 摇匀 吸取1微升注入气相色谱仪 计算校正因子 二 气相色谱法 示例松节油的含量测定测定法取本品约35mg 精密称定 置10mL棕色量瓶中 精密加入内标溶液2mL 用石油醚 30 60 C 溶解并稀释至刻度 摇匀 吸取1微升注入气相色谱仪 测定 即得 本品含 蒎烯 C10H16 不得少于70 外标法标准加入法 二 气相色谱法 1 结构特征与分析方法之间的关系 含卤素有机药物R X F Cl Br I 卤素与芳环相连Ar X结合牢固 需有机破坏卤素与脂肪链相连R X结合较不牢固 不需有机破坏 含金属有机药物含金属有机药物R O Me 有机酸或酚的金属盐 配位化合物 结合不牢固 可直接测定有机金属药物R Me 结合牢固 适当处理后测定 第二节样品分
