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1、第1节 大肠杆菌的培养和分离一、培养基的配置：我们用牛肉膏蛋白胨培养基来培养大肠杆菌。配置1000ml的培养基（可由教师在实验前配置好，也可由学生分小组后在实验课上操作）。1、配方：牛肉膏 5g蛋白胨 10gNacl 5g琼脂 20g2、称量：准确称取各成分。3、溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到1000mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。4、调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.07.2。5、灭菌：将配置好的培养基转移到锥形瓶中，加上棉塞，包上牛皮纸，用皮筋勒紧，集中放入高压灭菌锅内，121摄氏度、100千帕压力下灭菌15min。58套培养皿用旧报纸包作一
2、包，于干热灭菌锅内160170条件下灭菌2小时。6、倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至50左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。二、大肠杆菌的接种、培养：1、接种常用的方法有平板划线法和
3、稀释涂布平板法。（1）平板划线法：操作步骤：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 35条，转动培养皿约70角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。该方法原理及其注意事项：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在
4、划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养1020h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。（2）稀释涂布平板法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到105 107之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养
5、基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。2、培养：将接种后和未接种的培养基都放入37恒温箱中，培养12小时和24小时后，分别观察记录结果。三、实验评价相关问题：1、未接种的培养基是否有菌落？如果有，为什么？2、接种了大肠杆菌的培养基上是否有菌落？其颜色、形状、大小是否相同？3、如果培养基上出现了不同的菌落，请分析可能的原因。四、实验注意事项： 实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。灭菌后，通常在6080烘箱中除去灭菌时的水分； 物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高，随后关闭排气阀继续加热，加热结束切断热源后，要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸； 在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作； 培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，否则容易污染； 接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键； 接种后，培养皿必须倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表面，水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌落- 3 -用心 爱心 专心
