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1、1 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 转录组生物信息分析结题报告 一 建库测序流程 1 Total RNA样品检测 2 文库构建 3 库检 4 上机测序 二 生物信息分析流程 三 项目结果说明 1 原始序列数据 2 测序数据质量评估 3 参考序列比对分析 4 可变剪切分析 5 新转录本预测 6 SNP和InDel分析 7 基因表达水平分析 8 RNA seq整体质量评估 9 基因差异表达分析 10 差异基因GO富集分析 11 差异基因KEGG富集分析 12 差异基因蛋白互作
2、网络分析 13 DEU分析 四 参考文献 五 附录 1 文件目录列表 2 软件列表 3 Methods英文版 4 结题报告PDF版 2 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 一 建库测序流程 从RNA样品到最终数据获得 样品检测 建库 测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响 而数据质量又会直 接影响后续信息分析的结果 因此 获得高质量数据是保证生物信息分析正确 全面 可信的前提 为了从源头上保证 测序数据的准确性 可靠性 诺禾致源对样品检测
3、 建库 测序每一个生产步骤都严格把控 从根本上确保了高质量数 据的产出 流程图如下 3 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 1 Total RNA样品检测 诺禾致源对RNA样品的检测主要包括4种方法 1 琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染 2 Nanodrop检测RNA的纯度 OD260 280比值 3 Qubit对RNA浓度进行精确定量 4 Agilent 2100精确检测RNA的完整性 2 文库构建 样品检测合格后 用带有Ol
4、igo dT 的磁珠富集真核生物mRNA 若为原核生物 则通过试剂盒去除rRNA来富集 mRNA 随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段 以mRNA为模板 用六碱基随机引物 random hexamers 合成一链cDNA 然后加入缓冲液 dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA 随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA 纯化的双链cDNA再进行末端修复 加A尾并连接测序接头 然后用AMPure XP beads进行片段大小选择 最后进行PCR富集 得到最终的cDNA文库 构建原理图如下 3 库检 文库构建完成后 先使用Qubi
5、t2 0进行初步定量 稀释文库至1ng ul 随后使用Agilent 2100对文库的insert size 进行检测 insert size符合预期后 使用Q PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量 文库有效浓度 2nM 以保证 文库质量 4 上机测序 库检合格后 把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq MiSeq测序 4 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 二 生物信息分析流程 获得原始测序序列 Seq
6、uenced Reads 后 在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下 通过如下流程进行生物信 息分析 5 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 三 项目结果说明 1 原始序列数据 高通量测序 如illumina HiSeqTM2000 MiSeq等测序平台 测序得到的原始图像数据文件经碱基识别 Base Calling 分析转化为原始测序序列 Sequenced Reads 我们称之为Raw Data或Raw Reads 结果以FASTQ 简
7、称为fq 文件格式存 储 其中包含测序序列 reads 的序列信息以及其对应的测序质量信息 FASTQ格式文件中每个read由四行描述 如下 E A S 1 3 9 1 3 6 F C 7 0 6 V J 2 2 1 0 4 1 5 3 4 3 1 9 7 3 9 3 1 Y 1 8 A T C A C G G C T C T T T G C C C T T C T C G T C G A A A A T T G T C T C C T C A T T C G A A A C T T C T C T G T C F F F D E H H H H F I J J J F H G I I I E
8、 H I I J B H H H I J J E G I I J J I G H I G H C C F 其中第一行以 开头 随后为illumina 测序标识符 Sequence Identifiers 和描述文字 选择性部分 第二行 是碱基序列 第三行以 开头 随后为illumina 测序标识符 选择性部分 第四行是对应序列的测序质量 Cock et al illumina 测序标识符详细信息如下 EAS139Unique instrument name 136Run ID FC706VJFlowcell ID 2Flowcell lane 2104Tile number within th
9、e flowcell lane 15343 x coordinate of the cluster within the tile 197393 y coordinate of the cluster within the tile 1Member of a pair 1 or 2 paired end or mate pair reads only YY if the read fails filter read is bad N otherwise 180 when none of the control bits are on otherwise it is an even number
10、 ATCACGIndex sequence 第四行中每个字符对应的ASCII值减去33 即为对应第二行碱基的测序质量值 如果测序错误率用e表示 illumina HiSeqTM2000 MiSeq的碱基质量值用Qphred表示 则有下列关系 公式一 Qphred 10log10 e illumina Casava 1 8版本测序错误率与测序质量值简明对应关系如下 测序错误率测序质量值对应字符 5 13 1 205 0 1 30 0 01 40I 6 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport
11、html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 2 测序数据质量评估 2 1 测序错误率分布检查 每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值 Phred score Qphred 通过公式1转化得到 而Phred 数值是在碱基识别 Base Calling 过程中通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的 对应关系如下表所显示 illumina Casava 1 8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系 Phred分值不正确的碱基识别碱基正确识别率Q sorce 101 1090 Q10 201 10099 Q20 301 100099 9 Q30 401 1000099 99 Q40
12、 测序错误率与碱基质量有关 受测序仪本身 测序试剂 样品等多个因素共同影响 对于RNA seq技术 测序错误率 分布具有两个特点 1 测序错误率会随着测序序列 Sequenced Reads 长度的增加而升高 这是由于测序过程中化学试 剂的消耗而导致的 并且为illumina高通量测序平台都具有的特征 2 前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率 而这个长度也正好等于在RNA seq建库过程中反转录所需要的随机引物的长度 所以推测前6个碱基测序错误率较高的原 因为随机引物和RNA模版的不完全结合 Jiang et al 图2 1 测序错误率分布图 横坐标为reads的碱基位置 纵坐标为单碱基错
13、误率 7 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 2 2 GC含量分布检查 GC含量分布检查用于检测有无AT GC 分离现象 而这种现象可能是测序或者建库所带来的 并且会影响后续的定量 分析 在illumina测序平台的转录组测序中 反转录成cDNA时所用的6bp 的随机引物会引起前几个位置的核苷酸组成存在 一定的偏好性 而这种偏好性与测序的物种和实验室环境无关 但会影响转录组测序的均一化程度 Hansen et al 除 此之外 理论上G和C碱
14、基及A和T碱基含量每个测序循环上应分别相等 且整个测序过程稳定不变 呈水平线 对于DGE测 序来说 由于随机引物扩增偏差等原因 常常会导致在测序得到的每个read前6 7个碱基有较大的波动 这种波动属于正 常情况 图2 2 GC含量分布图 横坐标为reads的碱基位置 纵坐标为单碱基所占的比例 不同颜色代表不同的碱基类型 8 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 2 3 测序数据过滤 测序得到的原始测序序列 里面含有带接头的 低质量的reads
15、 为了保证信息分析质量 必须对raw reads进行过 滤 得到clean reads 后续分析都基于clean reads 数据处理的步骤如下 1 去除带接头 adapter 的reads 2 去除N N表示无法确定碱基信息 的比例大于10 的reads 3 去除低质量reads RNA seq 的接头 Adapter Oligonucleotide sequences for TruSeqTM RNA and DNA Sample Prep Kits 信息 RNA 5 Adapter RA5 part 15013205 5 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTT
16、TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3 RNA 3 Adapter RA3 part 15013207 5 GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 6位index ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3 图2 3 原始数据过滤结果 9 39C Documents and Settings Administrator 桌面 Gallus gallus TransRefReport html 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 2 4 测序数据质量情况汇总 表2 4 数据产出质量情况一览表 Sample nameRaw readsClean readsclean basesError rate Q20 Q30 GC content HS1 136579608351752053 52G0 0397 8892 8849 39 HS1 236579608351752053 52G0 0396 5090 3849 59 HS2 136547734351194633 51G0 0397 8592 8149 53 HS2 236547734351
