生物药物合成集落刺激因子

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1、重组人粒细胞集落因子 rhG CSF 的介绍及生产工艺 唐汉卿2111423036 细胞因子的概念 机体的免疫细胞和非免疫细胞能合成和分泌小分子的多肽类因子 它们能调节多种细胞生理功能 称为细胞因子 Cytokines 细胞因子包括淋巴细胞产生的淋巴因子和单核巨噬细胞产生的单核因子等 前言 白细胞介素 Interleukin IL 肿瘤坏死因子 Tumornecrosisfactor TNF 干扰素 Interferon IFN 集落刺激因子 Colonystimulatingfactor CSF 生长因子 Growthfactor GF 趋化因子 Chemokine 细胞因子分类 按功能分

2、前言 药物介绍 粒细胞集落刺激因子 granulocy colonystimulatingfactor G CSF 粒细胞集落刺激因子 granulocy colonystimulatingfactor G CSF 是一种促进中性粒细胞生长的细胞因子 G CSF的作用 主要是支持粒系造血肝细胞的生存 促进这些细胞分化为成熟的中性粒细胞 促进骨髓施放中性粒细胞 提高中性粒细胞吞噬抗原 形成氧自由基的能力 从而消灭细菌 本质 一种糖蛋白 含有174个氨基酸 分子量约为19 6KD PI 6 0 分子中有5个半胱氨酸残疾 形成2个二硫键来源 主要来源于巨噬细胞 内皮细胞及纤维母细胞 药物介绍 基因编

3、码的蛋白质基因定位在染色体17 它的基因含有5个外显子和4个内含子 现已成功地分离出两个cDNA 分别编码177个和174个氨基酸的蛋白质 分析表明两种形式的G一CSF都有生物活性 但作用上可能有所差别 药物介绍 适应症1 促进骨髓移植后中性粒细胞计数增加 2 癌症化疗引起的中性粒细胞减少症 包括恶性淋巴瘤 小细胞肺癌 胚胎细胞瘤 睾丸肿瘤 卵巢肿瘤等 神经母细胞瘤等 3 骨髓异常增生综合症伴发的中性粒细胞减少症 4 再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症 5 先天性 特发性中性粒细胞减少症 国外研究进展 1991年2月 安进公司的产品 重组粒细胞集落刺激因子Neupogen G CSF 获得美

4、国FDA批准 其适应症为自身骨髓移植 化疗导致的粒细胞减少症 AIDS等 Neulasta为安进公司开发的Neupogen的长效剂型 即通过对粒细胞集落刺激因子进行聚乙二醇 PEG 修饰 延长其在体内的代谢时间 因此疗效更好 Neulasta在2002年获得FDA的上市批准 并于2002年第二季度上市 Neulasta一上市就十分抢眼 2003年全年的销售额为13亿美元 其霸气直逼EPO 美国 1994年 日本中外制药株式会社研制成功并上市rhG CSF 其后是日本麒麟公司的rhG CSF 商品名 中文商品名 惠尔血 紧接着日本麒麟啤酒公司的rhG CSF进入中国市场 年销售额约为10亿日元

5、1995年又与中国药厂合作 在中国分装G CSF 分泌型重组人粒细胞集落刺激因子虽有一家国内公司已经投放市场 但因其工艺水平落后 没有形成产业规模 2008年分泌型重组人粒细胞集落刺激因子有一家日本公司已经形成产业规模 日本 国外研究进展 国内进展 国内主要生产企业包括杭州九源和长春高新 厦门特宝等 目前已有近20家企业的产品进入市场 销售战场已起硝烟 现我国有20多家企业生产重组粒细胞集落刺激因子 但规模都不大 竞争十分激烈 第二节 生产工艺 生产工艺 工艺流程 目的基因的发现 PCR扩增 聚合酶链式反应 PCR PCR扩增得到大量目的基因 之后导入到大肠杆菌中 制备成工程菌 发酵生产的种子

6、 工程菌发酵 高密度培养 高密度培养现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌 尤其是E coli 生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的 例如 人生长激素 胰岛素 白细胞介素类和人干扰素等 高密度培养方法 1 选取最佳培养基成分和各成分含量 2 补料 这是工程菌高密度培养的重要手段之一 3 提高溶解氧的浓度 提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一 4 防止有害代谢产物的生成 rhG CSF发酵生产的研究概况 1986年Nagata和Souza各自克隆了人G CSFcDNA 并在哺乳动物和原核细胞中进行表达 1993年瞿成奎等人在国内首先克隆了人G CSFcDNA 并在大肠

7、杆菌中获得表达 由于原核细胞表达系统缺乏糖基化等翻译后的加工能力 生产的G CSF在体内会部分讲解而降低药效 所以研究人员在真核细胞表达系统中进行了G CSF基因的构建 如在酵母 中国仓鼠卵巢细胞 CHO T抗原猴细胞系 COS7 等表达系统中均成功实现了G CSF的表达 为了使G CSF的产量有进一步的提高 研究人员还进行了将G CSF与其它细胞因子融合表达的研究 如崔立斌等人成功的获得了G CsF 硫氧还原蛋白融合蛋白的可溶性表达 表达水平为总细胞可溶蛋白的41 同时在rhG CSF发酵生产方面也进行了很多研究 如方向东等人构建的表达载体pJGW1转化E Coli 使rhG CSF表达量占

8、总蛋白的30 刘社际等研究了培养温度对工程菌生长和rhG CSF表达的影响 在发酵时采用不同的培养温度进行培养 连续三批发酵 细胞密度 0D600 达到25 0 菌体干重23g L rhG CSF表达量为26 9 胡志明等筛选了大肠杆菌表达rhG CSF的发酵工艺 在20L发酵罐中进行培养 菌体湿重为15 6g L rhG CSF表达量达到30 发酵工艺举例 一 工程菌的获得用带有rhG CSFa基因的pQE3表达载体转化E coliM15菌株 筛选能够稳定地表达rhG CSFa的重组菌株作为工程菌株 冻存于液氮中 发酵工艺举例 二 种子复性将在液氮甘油管中冻存的基因工程菌种接种于装有20mL

9、LB培养基 含Amp50mg L和Kan20mg L 的小试管中 37 200r min的条件下过夜培养 次日接种于装有500mL培养基的摇瓶中 培养至菌体OD600值打到所需要求后 将其作为一级种子 发酵工艺举例 三 40L发酵罐发酵将40L发酵罐空罐灭菌后加入30L培养基 蛋白胨20g L 酵母膏20g L 氯化钠5g L 进行实罐灭菌 冷却后将一级种子液接种于发酵罐中 节通气量和转速 维持溶氧在35 80 37 培养 当菌体OD600打到5 3时 加入7mM的IPTG诱导rhG CSFa表达 诱导1h后 加入2L已灭菌的5X培养基 蛋白胨100g L 酵母膏100g L 氯化钠25g L

10、 以补充营养 发酵过程中自动添加HCl和氨水 将发酵液pH维持在7 2左右 随时调节通气量和转速 保证溶氧维持在30 以上 异丙基硫代半乳糖苷 IPTG 是一种作用极强的诱导剂 不被细菌代谢而十分稳定 因此被实验室广泛应用 发酵工艺举例 四 发酵终止与产物分离诱导4h后终止发酵 酵液利用工业化自动连续离心机离心收集菌体 收集的菌体用裂解缓冲液 Tris50mmol L EDTA2mmol L NaCl100mmol L TritonX 1005 V V 溶菌酶1mg mL pH8 0 重悬 4 搅拌至黏稠 超声波破碎菌体至不黏 离心 7000r min 25min 获得包涵体 依次经过尿素缓冲

11、液 Tris50mmol L EDTA2mmol L Urea2mol L pH8 0 和纯水洗涤后得到较纯的包涵体 总结 现在的对于重组人粒细胞集落因子 rhG CSF 的研究主要有两个方向 一个方向是对其发酵条件的优化 另一个方向是对其药理作用的研究 生物药物占新药的比重越来越大 预计到2020年 生物制药产品有望占全球药品销售收入的1 3 但是国内的发展水平不高 我们既要看到不足 也要看到看到机会 参考文献 1 靳坤 李洋 李乾 等 我国生物制药研究进展及展望 J 现代生物医学进展 2O12 2 370 372 376 2 孟和宝力高 生物技术专业发展趋势及设想 J 解放军医药杂志 20

12、13 1 3 KaushanskyK Lineage specifichematopoieticgrowthfactors J NEnglJMed 2006 354 4 2034 2045 4 莫红楠 石远凯 孙燕 重组人粒细胞集落刺激因子在肿瘤化疗中应用20年回顾 J ChineseJournalofNewDrugs2013 22 17 2027 2032 5 DonadieuJ FenneteauO BeaupainB etal Congnitalneutropenia diagnosis molecularbasesandpatientmanagement J OrphanetJRare

13、Dis 2011 6 26 6 石远凯 孙燕 等 基因重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子预防化疗所致白细胞减少症的临床疗效观察 J 中华肿瘤杂志 1994 16 5 356 359 7 ShiYK ChenQ etal Pegylatedfilgrastimiscomparablewithfilgrastimassupportforcommonlyusedchemotherapyregimens amulticener randomized crossoverphase3study J AnticanerDrugs 2013 24 6 641 647 8 王海波 重组人粒细胞集落刺激因子生产工

14、艺的研究 西北大学 2002年 硕士论文 参考文献 9 专利 CN101153278A 10 宋爽 蒋文宏 等 新一代重组人粒细胞集落刺激因子的工业化发酵 复性和纯化 J 中国生物医学工程学报 2012 31 4 552 557 11 王娟 李希平 基因工程菌发酵表达rhG CSF的条件优化 J 药学研究 2014 33 7 428 430 12 郑剑 吴琳琳 李敏 乳糖诱导高分子量重组蛛丝蛋白发酵培养基优化 J 中国生物工程杂志 2008 28 12 41 46 13 ZhuF WangQ PuH etal Optimizationofsolublehumaninterferon rproductioninEscherichiacoliusingSUMOfusionpartner J WorldJMicrobiolBiotechnl 2013 29 2 319 325 14 林陈水老师课件 THANKYOU