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1、 1143 细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素 以判断供 试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法 细菌内毒素检查包括两种方法 即凝胶法和光度测定法 后者包括浊度法和 显色基质法 供试品检测时 可使用其中任何一种方法进行试验 当测定结果有 争议时 除另有规定外 以凝胶限度试验结果为准 本试验操作过程应防止内毒素的污染 细菌内毒素的量用内毒素单位 EU 表示 1EU 与 1 个内毒素国际单位 IU 相当 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成 用于标定 复核 仲 裁鲎试剂灵敏度 标定细菌内毒素工作标准品的效价 干扰试验及检查法中
2、编号 B 和 C 溶液的制备 凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验 光度测定法中标准曲线可 靠性试验 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价 用于 干扰试验及检查法中编号 B 和 C 溶液的制备 凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验 光度测定法中标准曲线可靠性试验 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准 其内毒素含量小于 0 015EU ml 用于凝胶法 或 0 005EU ml 用于光度测定法 且对内毒素试验 无干扰作用 试验所用的器皿需经处理 以去除可能存在的外源性内毒素 耐热 器皿常用干热灭菌法 250 30 分钟以上 去除 也可采用其他确证不干扰细 菌内毒素检查的适宜方法 若使
3、用塑料器具 如微孔板和与微量加样器配套的吸 头等 应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶 稀释或在水性溶液中浸提制成 供试品溶液 必要时 可调节被测溶液 或其稀释液 的 pH 值 一般供试品溶 液和鲎试剂混合后溶液的 pH 值在 6 0 8 0 的范围内为宜 可使用适宜的酸 碱溶液或缓冲液调节 pH 值 酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒 素的容器中配制 缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子 内毒素限值的确定内毒素限值的确定 药品 生物制品的细菌内毒素限值 L 一般按以下 公式确定 L K M 式中 L 为供试品的细菌内毒素
4、限值 一般以 EU ml EU mg 或 EU U 活性单 位 表示 K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量 以 EU kg h 表 示 注射剂 K 5EU kg h 放射性药品注射剂 K 2 5EU kg h 鞘内用注射剂 K 0 2EU kg h M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量 以 ml kg h mg kg h 或 U kg h 表示 人均体重按 60kg 计算 人体表面积按 1 62m2 计算 注射时间若不足 1 小时 按 1 小时计算 供试品每平方米体表 面积剂量乘以 0 027 即可转换为每千克体重剂量 M 按人用剂量计算限值时 如遇特殊情况 可根据生产和临床用
5、药实际情况做 必要调整 但需说明理由 确定最大有效稀释倍数 确定最大有效稀释倍数 MVD 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品 溶液被允许达到稀释的最大倍数 MVD 在不超过此稀释倍数的浓度下进行内 毒素限值的检测 用以下公式来确定 MVD MVD cL 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值 c 为供试品溶液的浓度 当 L 以 EU mg 或 EU U 表示时 c 的单位需为 mg ml 或 U ml 当 L 以 EU ml 表示时 则 c 等于 1 0ml ml 如需计算在 MVD 时的供试品浓度 即最小有效稀释浓度 可使用公式 c L 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度 EU ml 或是在光度测定
6、法中所使 用的标准曲线上最低的内毒素浓度 方法方法 1 凝胶法凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量 检测内毒素的方法 鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下 使鲎试剂产生凝集的内 毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度 用 EU ml 表示 当使用新批号的鲎 试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时 应进行鲎试剂灵敏度复 核试验 根据鲎试剂灵敏度的标示值 将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素 工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解 在旋涡混合器上混匀 15 分钟 然后制 成 2 0 5 和 0 25 四个浓度的内毒素标准溶液 每稀释
7、一步均应在旋 涡混合器上混匀 30 秒钟 取分装有 0 1ml 鲎试剂溶液的 10mm 75mm 试管或 复溶后的 0 1ml 支规格的鲎试剂原安瓿 18 支 其中 16 管分别加入 0 1ml 不同 浓度的内毒素标准溶液 每一个内毒素浓度平行做 4 管 另外 2 管加入 0 1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照 将试管中溶液轻轻混匀后 封闭管口 垂直 放入 37 1 的恒温器中 保温 60 分钟 2 分钟 将试管从恒温器中轻轻取出 缓缓倒转 180 若管内形成凝胶 并且凝胶 不变形 不从管壁滑脱者为阳性 未形成凝胶或形成的凝胶不坚实 变形并从管 壁滑脱者为阴性 保温和拿取试管过程应避免受到
8、振动造成假阴性结果 当最大浓度 2 管均为阳性 最低浓度 0 25 管均为阴性 阴性对照管为阴 性 试验方为有效 按下式计算反应终点浓度的几何平均值 即为鲎试剂灵敏度 的测定值 c c antilg X n 式中 X 为反应终点浓度的对数值 lg 反应终点浓度是指系列递减的内毒素 浓度中最后一个呈阳性结果的浓度 n 为每个浓度的平行管数 当 c 在 0 5 2 包括 0 5 和 2 时 方可用于细菌内毒素检查 并以标示灵敏度 为该批鲎试剂的灵敏度 干扰试验干扰试验 按表 1 制备溶液 A B C 和 D 使用的供试品溶液应为未检验 出内毒素且不超过最大有效稀释倍数 MVD 的溶液 按鲎试剂灵敏
9、度复核试 验项下操作 表表 1 凝胶法干扰试验溶液的制备凝胶法干扰试验溶液的制备 编号 内毒素浓度 配制内毒 素的溶液 稀释用液 稀释倍 数 所含内毒素 的浓度 平行管数 A 无 供试品溶液 2 1 2 4 B 2 供试品溶液 供试品溶液 2 1 4 4 0 5 4 8 0 25 4 1 2 2 2 1 2 4 0 5 2 C 2 检查用水 检查用水 8 0 25 2 D 无 检查用水 2 注 A 为供试品溶液 B 为干扰试验系列 C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D 为阴性对照 只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性 并且系列溶液 C 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时
10、试验方为有效 当系列溶液 B 的结 果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时 认为供试品在该浓度下无干扰作用 其他 情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用 若供试品溶液在小于 MVD 的稀释 倍数下对试验有干扰 应将供试品溶液进行不超过 MVD 的进一步稀释 再重复 干扰试验 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法 如过滤 中和 透析或加热处理等 排除干扰 为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不 会使内毒素失去活性 要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进 行干扰试验 当进行新药的内毒素检查试验前 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查 法时 须进行干扰试验 当鲎试剂 供试品
11、的处方 生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影 响试验结果的变化时 须重新进行干扰试验 检查法检查法 1 凝胶限度试验 凝胶限度试验 按表 2 制备溶液 A B C 和 D 使用稀释倍数不超过 MVD 并且已经排除 干扰的供试品溶液来制备溶液 A 和 B 按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作 表表 2 凝胶限度试验溶液的制备凝胶限度试验溶液的制备 编号 内毒素浓度 配制内毒素的溶液 平行管数 A 无 供试品溶液 2 B 2 供试品溶液 2 C 2 检查用水 2 D 无 检查用水 2 注 A 为供试品溶液 B 为供试品阳性对照 C 为阳性对照 D 为阴性对照 结果判断结果判断 保温 60 分钟 2
12、 分钟后观察结果 若阴性对照溶液 D 的平行管 均为阴性 供试品阳性对照溶液 B 的平行管均为阳性 阳性对照溶液 C 的平行 管均为阳性 试验有效 若溶液 A 的两个平行管均为阴性 判定供试品符合规定 若溶液 A 的两个平 行管均为阳性 判定供试品不符合规定 若溶液 A 的两个平行管中的一管为阳 性 另一管为阴性 需进行复试 复试时溶液 A 需做 4 支平行管 若所有平行 管均为阴性 判定供试品符合规定 否则判定供试品不符合规定 若供试品的稀 释倍数小于 MVD 而溶液 A 出现不符合规定时 需将供试品稀释至 MVD 重新实 验 再对结果进行判断 2 凝胶半定量试验 凝胶半定量试验 本方法系通
13、过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量 按表 3 制备 溶液 A B C 和 D 按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作 结果判断结果判断 若阴性对照溶液 D 的平行管均为阴性 供试品阳性对照溶液 B 的平行管均为阳性 系列溶液 C 的反应终点浓度的几何平均值在 0 5 2 试验有效 系列溶液 A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以 为每个系列的反应 终点浓度 如果检验的是经稀释的供试品 则将终点浓度乘以供试品进行半定量 试验的初始稀释倍数 即得到每一系列内毒素浓度 C 每一系列内毒素浓度的几 何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度 按公式 cE antilg X 2 如试验中供试品溶液的所有平行管
14、均为阴性 应记为内毒素浓度小于 如 果检验的是稀释过的供试品 则记为小于 乘以供试品进行半定量试验的初始稀 释倍数 若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值 判定供试品符合规定 若 任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时 则判定供试品不符合规定 不必计算 供试品的内毒素浓度 只有当供试品溶液的所有平行管均为阳性 应记为内毒素 的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以 表表 3 凝胶半定量试验溶液的制备凝胶半定量试验溶液的制备 编号 内毒素浓度 配制内 毒素的溶液 稀释用液稀释倍 数 所含内毒素的浓 度 平行管数 1 2 2 2 4 2 A 无 供试品溶液 检查用水 8 2 B 2 供试品溶液 1 2 2
15、1 2 2 2 1 2 4 0 5 2 C 2 检查用水 检查用水 8 0 25 2 D 无 检查用水 2 注 A 为不超过 MVD 并且通过干扰试验的供试品溶液 从通过干扰试验的任一稀释倍数开始用检查用水 进行系列稀释 且最后的稀释倍数不得超过 MVD 例如 1 倍 2 倍 4 倍和 8 倍 B 为含 2 浓度标准内毒素的溶液 A 供试品阳性对照 C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D 为阴性对照 方法方法 2 光度测定法光度测定法 光度测定法分为浊度法和显色基质法 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含 量的方法 根据检测原理 可分为终点浊度法和动态浊度法 终点浊度
16、法是依据 反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度 吸光度 光密度或透光率 之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法 动态浊度法是检测反应混合物的 浊度到达某一预先设定的浊度值所需要的反应时间 或是检测浊度增加速度的方 法 显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底 物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法 根据检测原理 分为终点显色 法和动态显色法 终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时 释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法 动态显色法 是检测反应混合物的吸光度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间 或检 测吸光度增加速度的方法 光度测定试验需在特定的仪器中进行 温度一般为 37 1 供试品和鲎试剂的加样量 供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等 参照所 用仪器和试剂的有关说明进行 为保证浊度和显色试验的有效性 应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供 试品的干扰试验 标准曲线的可靠性试验标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会 影响检验结果的改变时 需进行标准曲线的可靠性试验 用标准内毒素制成溶液
