分子克隆

《分子克隆》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子克隆（29页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、子克隆 报告人： 隆载体 C o n t e n t s 分子克隆 分子克隆（基因克隆、 通过体外重组技术 ,将一段目的 连接插入适当载体 ， 并导入受体细胞 ， 扩增形成大量子代分子的过程 。 分子克隆的核心是：体外重组即人工将一段目的 载体 目的 重组 宿主（ 筛选、扩增 克隆（ 分子克隆的路线 组 转化 载体的特性 1 分子较小，可携带比较大的 载体的特性 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制 2 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达 4 3 要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点 5 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移

2、，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制 有适合的标记，易于选择 6 1 2 3 4 质粒载体 噬菌体载体 酵母菌质粒载体 动植物病毒载体 克隆载体 质粒载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状 般大小约为数千碱基对，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做 为选择性标记的抗 药性基因，所以质 粒经过适当改选后 便可成为良好的载 体 噬菌体载体 一种典型的头 链线状 长 50 66个基因，在其分子两端各含有 12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为 噬菌体 一种典型的纤维状结构，其 噬菌体要小的多，长度仅 6407个核苷酸，通常为环状双链 13噬菌体 噬菌体结构 它本身是一种核蛋白，核心是

3、一段 构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的 噬菌体侵染周期中起着两种截然不同的作用 使已经注入细胞的线性 是使噬菌体当前噬菌体被从宿主细胞中切除后，此时其作为一个限制性内切核酸酶的识别序列 噬菌体的侵染模式 向其注入自身 链 成第二条链 (双链复制模式 00 200个后 ,通过滚环复制机制产生线状单链 装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出 。 变性 95C 延伸 70 退火 第一次循环 第二次循环 72 94 94 2 （ 35） 引物的设计 引物必须相应于模板分子相邻的序列，引物序列于对应的模板连应该是互补而不是相同的，这样杂交才会发生且杂交后的引物的 3 末端应该对着另

4、一条引物的 3 末端。最重要的是引物的长度，因为引物的长度影响其杂交到模板 物越长杂交所需的时间越长；引物太短可能与目标位点以外的位点相杂交，而扩增出我们并不需要的产物 退火温度 温度太高，不会有杂交发生引物与模板仍然相互分离；温度太低，又会有稳定的错误配对发生。退火温度有引物 定 ， (4*G+C)+(2*A+T)C A 限制性内切酶 B C D 逆转录酶 是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链 称限制酶或切割酶。根据限制酶作用特性，一般分为 、 和 型，其中常用的是 型限制酶 催化双链 而构成完整的 逆转录酶是一个多功能性酶 ， 至少具有以下 3种酶活性： 以单链 催化合成 具有 能水解

5、以 催化合成 主要用于聚合酶链式反应中 ， 能以 从结合在模板上的引物出发 ， 以 按碱基配对方式 ， 从5 方向合成新的 。0 75 时具有最佳的生物活性 分 获取目的基因和载体 接 目的基因与载体的连接 筛 重组 转 重组 目的基因的来源 合酶链反应 制备基因组 备 工合成基因 . 目的基因来源 的基因与载体的连接 粘性末端连接 平头末端连接 人工接头法 同源多聚尾连接法 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过成重组 有些限制酶只能将目的基因和载体时在 合成连接子 与 限制酶切割 ,产生粘性末端 连接，构建重组 要求 两个 则末端脱氧核苷酸转移酶也会在 3 坏了 重组

6、 转化： 以 质粒 作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 转染： 以 病毒 作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 转导： 以 噬菌体 作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 类型 感受态细胞 受体细胞经过一些特殊方法 （ 如 的处理后 ， 细胞膜的通透性发生变化 ， 成为能容许多有外源 重组 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 限制酶切图谱筛选 原位杂交技术 4 1 2 3 重组 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法 。 具有抗药性标记的载体转化宿主细胞后 ， 能在含抗生素 （ 培养平板上生长；未转化的则不能生长 平板筛选的种类 当外源 使该基因失活 ， 转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上 插入失活 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌 蓝白筛选 载体 宿主 编码 端序列 （ 编码 端序列 细菌表达： 543 形成 蓝色菌落 当在质粒中 插入外源 端基因失活 不能与宿主 端进行 产生 白色菌落