第三章 线粒体功能及其相关毒性作用PPT课件

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1、线粒体及其相关毒性作用 高度动态的细胞器 线粒体的大小 数量和分布反应了细胞对能量的需求 线粒体的基本结构 线粒体外膜外膜上分布有孔蛋白 porin 构成的桶装通道 直径2 3nm 当孔蛋白通道完全打开时 可以通过相对分子质量高达5000的分子 ATP NAD 辅酶A等相对分子质量小于1000的物质均可自由通过外膜 因此 外膜的通透性很高 膜间空间中的离子环境几乎与胞质相同 线粒体内膜 内膜具有很高的蛋白质 脂质比 缺乏胆固醇 富含心磷脂 内膜具有极高的不透性 因此限制了所有分子和离子的自由通过 是质子电化学梯度的建立以及ATP合成所必须的 线粒体内膜上的蛋白主要执行三种功能 1 电子传递链

2、2 ATP合成 3 转运蛋白 线粒体膜间隙 膜间隙的宽度通常为6 8nm 在呼吸活跃时 膜间隙可显著扩大 含有可溶性酶类 底物以及辅助因子 其含有的腺苷酸激酶可以催化ATP分子末端磷酸基团转移到AMP 生成ADP 线粒体基质 线粒体基质富含可溶性蛋白胶状物 具有稳定的pH和渗透压 具有催化三羧酸循环 脂肪酸氧化和氨基酸降解的相关酶类 含有DNA RNA 核糖体 线粒体的分离 线粒体产能 ATP 示意图 6 线粒体是糖类 脂类和蛋白质最终氧化释能的场所 TCA是物质氧化的最终共同途径 氧化磷酸化是生物体获得能量的主要途径 一 线粒体中的氧化代谢 在电子传递的过程中 接受和释放的电子的分子和原子被

3、称为电子载体 由电子载体组成的电子传递序列被称为电子传递链 五种类型电子载体 黄素蛋白 细胞色素 泛醌 铁硫蛋白和铜原子 除泛醌外 其他氧化还原中心都是与蛋白质相连的辅基 呼吸链中的电子载体有严格的排列顺序和方向 按氧化还原电位由低向高排列 NAD NADH最低 O2 H2O最高 二 电子传递链与电子传递 9 电子传递复合物 组成两种呼吸链 NADH呼吸链 FADH2呼吸链 电子传递链各组分在线粒体内膜上不对称分布 电子传递复合物 复合物 NADH CoQ还原酶 既是电子传递体又是质子移位体 组成 含42个蛋白亚基 至少6个Fe S中心和1个黄素蛋白 作用 催化1对电子从NADH 辅酶Q 泵出

4、4H 复合物 琥珀酸 CoQ还原酶 是电子传递体而非质子移位体 组成 含FAD辅基 2Fe S中心 作用 催化1对低能电子 FAD Fe S 辅酶Q 无H 泵出 复合物 CoQ Cytc还原酶 既是电子传递体又是质子移位体 组成 包括1个cytc1 1个cytb 1个Fe S蛋白作用 催化电子从UQH2 cytc 泵出4H 2个来自UQ 2个来自基质 复合物 细胞色素c氧化酶 既是电子传递体又是质子移位体 组成 二聚体 每一单体含13个亚基 三维构象 cyta cyta3 Cu Fe作用 催化电子从cytc 分子O2形成水 2H 泵出 2H 参与形成水 线粒体承担的能量转换实质上就是把H 跨膜

5、电位差和质子浓度梯度形成的质子驱动力转换成ATP分子中的高能磷酸键 TCA循环提供的质子驱动力和高能电子是线粒体合成ATP的基本能源 三 质子转移与驱动力的形成 Ca2 调控 氧化 电子传递 放能 与磷酸化 ADP Pi 储能 同时进行 密切耦联 分别由两个不同的结构体系实现 用超声波将线粒体破碎 线粒体内膜碎片可自然卷成颗粒朝外的小膜泡 这种小膜泡称为亚线粒体小泡或亚线粒体颗粒 四 ATP形成机制 氧化磷酸化 ATP合酶的结构与组成 ATP合酶是最终生成ATP的装置 它分布于细菌质膜 线粒体内膜和叶绿体类囊体膜上 ATP合酶的分子由球形的头部和基部组成 线粒体主要功能是高效地将有机物中储存的

6、能量转换为细胞生命活动的直接能源ATP 与细胞中氧自由基的生成 调节细胞氧化还原电位和信号转导 调控细胞凋亡 细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态平衡 线粒体功能小结 线粒体的损伤 线粒体渗透转变细胞内Ca2 异常ATP合成酶异常自由基的产生和积累原发性代谢紊乱的相互作用线粒体DNA异常 线粒体渗透转变 MPT 线粒体摄取Ca2 渗透势下降 ROS和RNS生成 ATP耗竭和原发性代谢紊乱都会引起线粒体内膜通透性 MPT 突然升高 MPT是一种跨越线粒体内外膜间的蛋白质孔 巨通道 开放引起的 这个通道对于分子质量小于1500的溶质可通透 它的开放使质子自由的内流进入 引起膜电位迅速和完全耗散 A

7、TP合成的中断以及水的渗透内流 导致线粒体膨胀 已经蓄积于基质间隙的Ca2 通过此孔大量流出 进入细胞质 这样的线粒体不仅不能合成ATP 而且由于内膜的去极化迫使ATP合酶以相反的模式 水解ATP 将余留的能源全部耗尽 如果细胞中大部分或全部的线粒体都发生渗透转变 细胞溶解坏死将达到巅峰 在动物细胞线粒体膜上存在渗透性转换孔 PTP 当PTP开放时 线粒体内膜对中低分子量的化合物的渗透性会突然增加 从而导致线粒体基质中分子量小于1 5kD的游离物质渗透进入膜间空间 这个过程称为线粒体渗透性转换 mitochondrionpermeabilitytransition MPT 细胞内的钙库 细胞内

8、储存Ca2 库包括肌质网 线粒体 负责肌细胞细胞质中钙离子的调节 心肌细胞去极化时释放钙离子 复极化时摄取钙离子 心衰时 肌质网功能障碍的原因之一是能量的缺乏 ATP依赖的Ca2 泵功能降低 导致心肌复极化时不能有效摄取钙离子 去极化时又不能及时释放钙离子 线粒体在正常情况下可以摄取细胞总Ca2 量的20 这与线粒体中生物氧化酶的功能有关 在心衰出现时 细胞内pH的改变影响线粒体内Ca2 稳态 使线粒体摄取钙离子增多 当Ca2 超载时 引起线粒体功能障碍 19 Ca2 浓度的持续升高 高血压 Ca2 释放的增加使更多的钙离子进入平滑肌细胞 同时还促进了细胞内储存Ca2 的释放 细胞内储存钙的释

9、放再加上细胞外钙离子的内流可引起血管平滑肌的收缩 且影响细胞的生长 造成血管肥大 导致结构性和功能性外周阻力增高 血压增高 帕金森病 在正常情况下 神经元中持久的钙离子信号转到的影响是受到线粒体Ca2 释放和累积的调节 定位于线粒体内膜上的呼吸链蛋白复合体 从线粒体机制排出质子 产生一个150v 180mv 内侧负 的线粒体膜电位 这个电化学梯度驱动了ATP的合成并且提供了Ca2 在线粒体内侧的转运 在PD病人中 线粒体功能异常使钙离子超载 导致多巴胺神经元更加兴奋 ATP合酶的工作特点 可逆性复合酶 ATP耗竭 主要的能量物质 参与生物合成以及磷酸化 肌肉收缩 细胞骨架聚合 细胞运动 细胞分

10、裂 膜泡转运 质膜和内质网膜上的钙泵 溶酶体膜质子泵等多种离子泵功能失常 线粒体功能的异常 氧化磷酸化过程受到损害 ADP堆积 ATP耗竭 细胞内酸中毒 离子堆积 细胞容量调节失控 最终导致细胞膜的不可逆损伤 自由基的产生 自由基 自由基是指能够独立存在的具有一个或者多个不配对电子的任何核素 原子 原子团 分子 species 具有很高的化学活性 在生物体中最重要的自由基是活性氧 ROS reactivexoxygenspecies 尤其是超氧阴离子 O2 和羟自由基 OH 以及分子氧 自由基极易给出电子或者俘获电子 分类 可以分为氧自由基和脂自由基 从活性氧角度可以分成氧自由基 过氧化物 过

11、氧化氢 氢过氧化物 激发态氧 22 自由基的产生 线粒体 是氧自由基生成的主要场所之一 作为线粒体正常代谢的副产品 自由基在线粒体内会不断积累产生 在氧化磷酸化的过程中 有1 5 的氧会逃离正常的细胞色素氧化酶催化过程 经过非催化形式 逐步的非共价还原形成自由基 主要是超氧阴离子和过氧化氢 在线粒体呼吸链中 还原性的CoQ 黄素蛋白 细胞色素C等均可产生超氧阴离子 23 自由基的正常功能 代谢储能 体内约17 的自由基是在氧代谢的过程中产生的 如ATP合成 转化排泄 体内代谢产物 外源性的药物及毒物从体内清除是 均需在加单氧酶系作用下经过羟化反应 经尿或者胆汁排出 防御杀菌和抗肿瘤 吞噬细胞在

12、吞噬活动中被激活 耗氧量增加显著 即所谓呼吸爆发 所摄取的氧大部分产生过氧化氢 超氧阴离子以杀灭微生物 寄生虫并且可以破坏癌细胞 进一步氧化 可以消化被吞噬的异物 阿霉素通过转化形成自由基破坏癌细胞DNA 同时损伤正常细胞 24 自由基损害作用 对脂类的作用 生物膜中的不饱和脂肪酸受到自由基的作用而转变成过氧化脂质 从而导致膜的流动性改变 膜流动性下降导致细胞脆性增加 膜受体 离子通道异常 变形能力下降 出现动脉粥样硬化等 同样线粒体膜和溶酶体膜的脂质过氧化反应也会出现相同的后果 并且脂质过氧化会诱发新的自由基的产生 对蛋白质的作用 会造成蛋白质的交联 聚合和肽链的断裂 也可以使蛋白质和脂类结

13、合形成聚合物 是蛋白质丧失功能 25 自由基损害作用 对核酸的作用 自由基作用于DNA 与碱基发生加成反应 造成对碱基的修饰 从而引起基因突变 也可以引起DNA链的断裂 以及染色体畸变和染色体断裂 对细胞外基质的破坏 氧自由基可以使细胞外基质中胶原纤维的胶原蛋白发生交联 使透明质酸降解 从而引起基质变得疏松 弹性下降 出现皱纹 心肌缺血再灌注 狗冠状动脉结扎 突然松开恢复灌流 室颤死亡 缺血为自由基的形成提供了有利条件 再灌流则像是加入了催化剂使自由基瞬时大量生成 应预先给予自由基清除剂 26 三种原发性代谢紊乱的相互作用 线粒体的损伤 在医学上 由线粒体功能障碍引起的疾病称为线粒体病 线粒体

14、疾病都为母系遗传 外界环境因素对线粒体功能的影响 克山病 细胞中线粒体的数量随年龄增长而减少 而体积却随年龄增长而增大 人类线粒体疾病其原发机制都是mtDNA异常 突变 缺失 重排 引起的遗传性疾病 表现为电子传递酶系和氧化磷酸化酶系的异常 诱导因素之一为氧自由基 机体衰老即退行性疾病时 Mn SOD活性降低 氧自由基就积累在线粒体中 从而导致多种疾病的发生 氧自由基造成mtDNA氧化损伤的积累量可比核DNA高16倍 同时mtDNA不具有核基因的修复装置 因此mtDNA发生突变的频率比细胞核高10倍以上 线粒体损伤的检测 线粒体膜势能检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用 多种细胞凋亡刺激

15、因子均可诱导不同的细胞发生凋亡 而线粒体跨膜电位的下降 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件 它发生在细胞核凋亡特征 染色质浓缩 DNA断裂 出现之前 一旦线粒体崩溃 则细胞凋亡不可逆转 线粒体跨膜电位的存在 使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质 其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低 线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用 多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡 而线粒体跨膜电位的下降 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件 它发生在细胞核凋亡特征 染色质浓缩 DNA断裂 出现之前 一旦线粒体崩溃 则细胞凋亡不可逆转 线粒体跨膜电位

16、的存在 使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质 其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低 JC 1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探 可以检测细胞 组织或纯化的线粒体膜电位 在线粒体膜电位较高时 JC 1聚集在线粒体的基质中 形成聚合物 可以产生红色荧光 在线粒体膜电位较低时 JC 1不能聚集在线粒体的基质中 此时JC 1为单体 可以产生绿色荧光 这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化 常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例 线粒体膜势能的检测 JC 1单体的最大激发波长为514nm 最大发射波长为529nm JC 1聚合物 J aggregates 的最大激发波长为585nm 最大发射波长为590nm 实际观察时 使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可 通常可以CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件 通过JC 1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降 同时也可以用JC 1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标 实验步骤及注意事项 实