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1、金银花药材原植物鉴别与有效成分分布规律研究金银花药材原植物鉴别与有效成分分布规律研究摘 要：根据金银花药材质量存在较大差异的现状，利用光学显微镜和扫描电子显微镜分别观察比较了5种金银花药材原植物（忍冬、山银花、红腺忍冬、水忍冬、大花忍冬）的叶表皮特征及茎、叶解剖结构，结果表明这些特征可有效地用于金银花药材原植物的物种鉴别；同时，利用荧光显微镜观察探索了金银花药材中的主要有效成分绿原酸在山银花不同发育时期花蕾中的分布规律。关键词：金银花；物种鉴别；绿原酸分布；质量控制金银花药材(Flos Lonicerae)为一种常用大宗的中药材，具有悠久的药用历史。其原植物来源于忍冬科忍冬属多年生、半常绿、缠
2、绕藤本植物，花、茎、叶皆可入药，其中干燥的花蕾（有些带有初开的花）供药用，商品名为金银花；而茎、叶入药，则称为忍冬藤。金银花味甘、性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、凉散风热的作用，可用于治疗温病发热、风热感冒、咽喉肿痛、肺炎、丹毒、蜂窝状组织炎、痢疾等多种疾病。忍冬藤的作用与金银花相似，除具有清热解毒功能外，还具有通经活络的功能，常与怯风湿类药物配伍以治疗风湿痛,2。目前，金银花药材质量存在较大差异，药材质量难以控制，已严重地影响到药厂投料和临床用药的准确性。究其原因，一方面与商品药材的种源不清有关，另一方面与药材采收期有关。中国药典 3收载了忍冬科植物忍冬（Lonicera japonic
3、a Thunb.）、红腺忍冬(L. hypoglauca Miq.)、山银花(L. confusa DC.)和水忍冬（毛花柱忍冬）(L. dasystyla Rehd.)为金银花的四种法定药用品种，但各地尚有许多习用的种类，由此造成了药材种源上的极大混乱。现有研究已证明，金银花药材中的主要有效成分为绿原酸，其含量在不同物种中有着极大差异,5。而采自不同发育阶段的花蕾，其药材中的绿原酸含量也存在着较大的差异6。前人从植物形态、花粉等方面进行了一些相关的物种鉴定研究7，8。但对于药材鉴定来说，尚缺乏足够的准确性和实用性。而对金银花药材中主要有效成分绿原酸在植物体内的分布状况，至今尚未见相关的研究报
4、道。因此，有必要进一步开展金银花药材物种鉴定方面的研究，并探求绿原酸在植物体内的分布规律。1 材料和方法 实验材料包括5种金银花药材原植物：忍冬Lonicera japonica Thunb.（采自广东河源、梅州）、山银花L. confusa DC.（采自广东惠东、惠阳、罗浮山）、红腺忍冬L. hypoglauca Miq.（采自广东河源）、水忍冬（毛花柱忍冬）L. dasystyla Rehd.（采自广东惠阳）、大花忍冬L. macrantha 。每种植物取其南向、中部的成熟叶片、一或二年生茎；山银花分别取幼蕾期（绿色小花蕾）、三青期（绿色花蕾）、二白期（淡绿色花蕾）、大白期（白色花蕾）、银
5、花期（刚开放的白色花）和金花期（花瓣变黄色）发育正常的花蕾或花。1. 1石蜡切片 将采集的材料清洗干净，取叶片中部至边缘部分及主脉部分，切成约1cm2小块，将茎切成长1cm的小段，FAA固定，酒精系列脱水，石蜡包埋，切片厚812m，番红固绿染色。在LEICA DMLB显微镜下观察、照相，各种测量结果均为5枚叶片或茎各5个数值的平均值。1. 2叶表皮撕片 将新鲜叶片中部切成5x5mm2的小块，放入10铬酸和10硝酸溶液中，在遮光处处理10-15小时，蒸馏水冲洗，剥离表皮，番红溶液染色，蒸馏水漂洗，10甘油封片。在LEICA DMLB显微镜下观察、照相，各种测量结果均为5枚叶表皮各5个数值的平均值
6、。1. 3扫描电镜观察 取新鲜叶片中部切成5x5mm2小块，酒精系列脱水，用双面胶带粘贴在样品台上，喷金镀膜后在FEI-XL30 ESEM环境扫描电子显微镜下观察，照相。1. 4荧光显微镜观察分别取山银花不同发育时期的新鲜花蕾或花，徒手切片，将LEICA DMLB显微镜设置为紫外光源，然后进行观察、照相。2 观察结果2.1 叶片的比较解剖学研究2.1.1 叶表皮光镜特征 5种植物叶表皮光镜下的观察结果见表1。其上、下表皮细胞均为长方形或长圆形，其中上表皮细胞垂周壁平直或波状（图版I，1-3，5，7-8）；下表皮细胞垂周壁均为波状稍平；气孔均为无规则型（图版I，4，6）；气孔器大小在不同种间略有
7、差异，其长度为21.36-29.96 m，宽度为18.09-20.70m；气孔器都分布在叶片的下表皮，上表皮未见有气孔分布；但气孔密度在各种间有明显差异，其中，水忍冬气孔器分布最为稀疏，仅有170.4个/mm2；而红腺忍冬的气孔器分布则最为密集，达到466.3个/mm2（图版I，6）。表1 5种金银花药材原植物叶表皮光镜特征特征种名 气孔大小气孔类型气孔器密度(个)mm2气孔指数表皮图版长度m宽度m长宽比上表皮 下表皮 细胞形状垂周壁式样细胞形状垂周壁式样忍冬26.9420.701.30无规则型287.014.88长方形或方形平直长方形稍平图版I，1、2山银花21.3618.091.18无规则
8、型255.615.43不规则波状稍平不规则稍平图版1，3、4红腺忍冬23.0520.261.14无规则型466.319.78不规则波状稍平不规则波状图版1，5、6水忍冬29.9619.901.51无规则型170.420.65长方形或方形平直不规则波状稍平图版1，7大花忍冬25.0520.351.23无规则型318.316.19多边形平直多边形波状图版1，8注：气孔指数为单位视野气孔数/（单位视野气孔数+单位视野普通表皮细胞数）2.1.2 叶表皮电镜特征 在扫描电镜下观察，5种植物上、下表皮细胞垂周壁均呈不同程度的凸起，使表皮细胞轮廓清晰可见（图版II，1-5），但凸起的程度和方式有所不同。从上
9、表面来看，忍冬的垂周璧呈不规则的皱褶状强烈凸起（图版II，1）；山银花的凸起呈浅波状并略有皱褶（图版II，2）；红腺忍冬的凸起程度较浅，呈直的浅波状（图版II，3）；水忍冬则凸起明显，呈平直的板状，并有清晰的条纹状角质覆盖（图版II，4）；大花忍冬的垂周壁明显较宽，呈平直的强烈凸起(图版II，5)。从下表面观察，几种植物的气孔器近圆形或长圆形，仅分布于下表面，明显突出于表皮细胞（图版II，6-10）。气孔器具有较厚角质层形成的外拱盖，外拱盖表面平滑，只有水忍冬的外拱盖具庞状突起（图版III，4）。在外拱盖的外侧，均具有一轮厚角质层形成的突起。这种突起的宽度及与外拱盖间的距离，在不同种间存在明显
10、不同：忍冬的角质突起较薄，与外拱盖间形成较深的纵沟(图版III，1)；山银花的突起则较厚，与外拱盖间形成狭沟（图版III，2）；红腺忍冬的突起最厚且圆滑，与外拱盖间形成极浅的沟（图版III，3）；水忍冬的突起最薄，与外拱盖间形成极宽的沟，且有条纹状突起的角质相连（图版III，4）；大花忍冬的突起较厚，与外拱盖间形成的沟较宽而深，且在沟中部明显隆起，占沟长度近1/3（图版III，5）。2.1.3 叶片解剖结构特征 5种植物叶片解剖结构较相似，都是由表皮、栅栏组织、海绵组织、叶脉几部分组成，但各个种又有细微的区别（见图版IV和表2）。其中水忍冬的上表皮角质层非常薄，忍冬、红腺忍冬厚度相近，山银花角
11、质层较厚，而大花忍冬则最厚；水忍冬只有1层栅栏组织，山银花、红腺忍冬有12层，金银花、大花忍冬则有23层的栅栏组织；从海绵组织与栅栏组织的比例来看，红腺忍冬的比值大，达到2：1，忍冬、山银花二种的比值也较大，水忍冬、大花忍冬则较小，只有1：1；叶肉组织中均有含晶细胞，主要分布于海绵组织中，但栅栏组织中也有少量分布，只在忍冬中没有分布。除此而外，主脉的基本组织中也有含晶细胞分布，但金银花和水忍冬的主脉中明显稀疏。含晶细胞中的晶体除水忍冬中为针晶外，其余均为簇晶，忍冬、红腺忍冬中的簇晶较小，而山银花、大花忍冬的簇晶比较大；水忍冬的叶片很薄，山银花与红腺忍冬厚度相近，忍冬较厚，大花忍冬最厚。表2 5
12、种金银花药材原植物叶片解剖结构特征 特征 种名上表皮角质层厚度 (m)叶片厚度(m)栅栏组织层数海绵组织与栅栏组织厚度比簇晶的分布状况表皮细胞直径(m)切向径向忍冬2.5620.1023层1.8：1较少且小，分布在海绵组织，栅栏组织和海绵组织交界处，主脉上少。12.834.56；平均21.2512.8057.60；平均33.28山银花4.6115.6212层1.6：1海绵组织，栅栏组织，栅栏组织和海绵组织交界处皆有分布。17.9238.4平均26.8817.9264.00平均37.12红腺忍冬2.5614.2612层2：1较小，海绵组织，栅栏组织，栅栏组织和海绵组织交界处皆有分布。17.923
13、0.46平均23.0419.9751.20平均28.16水忍冬1.2812.751层1：1海绵组织和栅栏组织中有分布，主脉上分布少。24.3243.52平均30.7215.6244.80平均35.84大花忍冬6.1427.3923层1：1海绵组织，栅栏组织，栅栏组织和海绵组织交界处皆有分布。12.8035.84平均26.1117.9270.40平均38.472.2 5种金银花药材原植物茎解剖结构特征 5种植物茎的结构在横切面上由外至内包括：周皮、皮层、次生韧皮部、维管形成层、次生木质部、初生木质部、和髓等几部分，较为相似(图版V)。但水忍冬显示出一定差异，其皮层细胞呈长方形，排列整齐，且皮层中
14、未形成明显的厚壁细胞纤维带 (图版V，6-7)；而红腺忍冬的次生韧皮部中有较大的含晶细胞(图版V，5)。2.3山银花不同发育阶段花及茎、叶中绿原酸分布规律观察2.3.1 不同发育阶段花的解剖结构特征 分别对幼蕾期、三青期、二白期、大白期、银花期和金花期6个发育阶段的山银花花蕾或花，从萼筒中部、花冠筒中部2个部位的横切面进行观察，结果如下： 萼筒中部结构特征：由于忍冬属的花为下位子房，萼筒与子房壁愈合在一起。因此，在横切面上由外至内，该部位的结构可分为：萼筒子房壁、子房室、中轴胎座和胚珠几个部分（图版VI，1-2）。各时期花蕾的萼筒子房壁处显示出较明显的变化：整个萼筒子房壁的厚度由幼蕾期至大白期呈逐渐增加的趋势（图版VI，3-6），而后则无明显增加；萼筒子房壁的外表皮细胞呈逐渐分化的趋势，幼蕾期、三青期和二白期其细胞核较大，位于细胞中央（图版VI，3-6），而大白期，由于细胞中大液泡的形成，细胞核被挤向于一侧或解体（图版VI，6）；萼筒子房壁外表皮下的几层细胞排列较整齐，明显不同于其内的基本组织细胞，由幼蕾期至大白期该处不断处于细胞分裂之中，细胞层数由幼蕾期的2
