《课题研究-系统获得抗病性基因转化烟草的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《课题研究-系统获得抗病性基因转化烟草的研究（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、系统获得抗病性基因转化烟草的研究系统获得抗病性基因转化烟草的研究摘 要: 本研究是将系统获得性抗病性的调控基因NPR1通过农杆菌介导、转入烟草植株内，经PCR检测植株含有目的基因 ，然后进行转基因植株的抗病性测定，检测其是否有广普抗病性。通过此实验将进一步证明基因工程在抗病育种生产上的重要性. 关键词: 植物系统获得性抗病(SAR)；烟草；农杆菌；PCR检测1 前言1983年,世界上首例转基因植物问世，随后基因工程越来越受到世界各国的关注，基因工程也得以飞速的发展，育成了一大批抗病、抗虫、抗寒的高产、优质农作物新品种和植物材料，并开始在农业生产上大面积推广应用。据统计，到目前为止转基因在120
2、 种植物上获得成功，有3000 多例转基因植物进入田间试验，在美国和加拿大有50 多种转基因植物进入商品化生产。基因工程具有广阔的前景，它将在人类的生活中发挥越来越重要的作用。烟草是研究转基因的常用模式植物。在植物基因转化方法的选择上，本文采用农杆菌转化系统。在表达载体的构建中，采用一个能同时转化单、双子叶植物的高效表达载体pCAMBIA2300NPR1。然后采用冻融法成功地将重组质粒转化到了根癌农杆菌菌株EHA105 中,用农杆菌介导的烟草叶盘转化法进行了转基因研究。在农杆菌侵染叶盘以后，进行丛生芽诱导和生根诱导，将诱导生根的苗移栽后对烟草苗进行PCR 检测。 植物系统获得性抗病(Syste
3、mic Acquired Resistance,SAR)是指在一定的生物或非生物因子刺激下,在非刺激部位产生的对随后的病原物侵染具有较不受处理情况下更强的抵抗性的特征。系统获得抗性最初是由Ross(1961)描述烟草用TMV预接种后,可使植株获得对TMV再接种具有抗性时采用的,是植物病害抗性中起重要作用的一种诱导防卫机制。 我国目前关于转基因抗病毒烟草研究已有许多成功的报道，如北京大学植物基因工程与蛋白质工程国家重点实验室与辽宁丹东农科所协作，利用TMN-CP基因转育出抗TMV香料烟品系“PK-873”，又以转基因材料MSG28为母本与90082(转CMN-CP基因)杂交选育出抗CMV的烤烟品
4、系“PK-863”，中国科学院微生物所与河南农科院合作，通过双价质粒的构建(抗TMV、CMV)获得双抗转基因烟草,以及利用CMV-CP和卫星RNA策略获得烤烟品种NC89转基因品系等等。2 实验材料与方法2.1 材料2.1.1 植物材料及毒源 烟草K326R3代纯和系种子、TMV毒源（繁殖于普通烟草），均由本实验室提供。2.1.2 农杆菌菌株及质粒 农杆菌菌株EHA105、含高效表达载体pCAMBIA2300NPR1，均由邓晓玲副教授提供。2.1.4 主要仪器 美国Biometra公司UNO型PCR仪、美国Gene公司AmpR9700型PCR仪;德国Heraeus公司Labofuge400R型
5、冷冻高速离心机、台式高速离心机；美国Ultraviolet公司UVP凝胶成像系统；国产单人型超净工作台等。2.1.5 PCR引物合成2.1.6 培养基配方 培养基类型原料 MS0（每升）MS1（每升）MS2（每升）MS3（每升）MSMS1000mlMS1000mlMS1000ml1/2MS1000ml6-BA2.0mg2.0mgNAA0.2mg0.2mg头孢霉素250mg羧苄青霉素250mg卡那霉素75mg50mg蔗糖30g30g30g30g植物凝胶2.8g2.8g2.8gPH值5.85.85.85.8 MS混合物 (如下表)原料大量元素20倍CaCl2100倍Fe盐100倍肌醇200倍微量元
6、素1000倍微生素1000倍Gly 1mg/ml用量（ml/L）5010105112 2.2 方法2.2.1 烟草转化外植体的获得及消毒 将烟草种子播种于盆中，网室内防虫培养至35片真叶时，取嫩叶为外植体。用75%的乙醇处理叶片数秒钟，取出叶片，再用0.2%的氯化汞处理叶子78min，然后用无菌水清洗3遍，用无菌滤纸将叶片表面水分吸干。2.2.2 烟草叶盘及农杆菌对抗菌素Carb、Kan 的敏感性试验 将灭菌的烟草叶片切成0.50.5cm2的小块，接入含羧苄青霉素（Carbenicillin,Carb）、卡那霉素（Kananmycin,Kan）的MS2分化培养基，培养20天，观察外植体的生长情
7、况；将重组农杆菌EHA105接入含羧苄青霉素（Carbenicillin,Carb）、卡那霉素（Kananmycin,Kan）的LB培养基中，培养3天，观察农杆菌生长情况。2.2.3植物表达载质粒DNA的抽提 吸取液体培养基的农杆菌菌液1.5ml至1.5ml离心管中，若干管。离心力5000g下，离心2min，弃上清液，加入150L溶液，充分悬浮菌体。加入250LL溶液，温和混匀，温室下放置5min。加入180L预冷的溶液，温和混匀，-20 下冰箱放置5min。离心力12000g下，离心5min。移取上清液，加2/3倍体积的酚/氯仿抽提（1:1），离心力12000g下，离心5min。取上清液，加
8、2倍体积室温乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc，混匀。离心力12000g下，离心10min，倒掉酒精，用70酒精洗DNA沉淀一次，弃上清液，风干使酒精挥发。加100L TE（含10g/ml RNAase）溶解DNA沉淀，4下保存备用。 质粒DNA的进一步纯化:4下保存的DNA，加入100L酚/氯仿，充分振荡，离心力12000g下，离心5min，吸取上清液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc，混匀。置于-20下冰箱30min，离心力12000g下，离心15min，倒掉酒精，用70酒精洗DNA沉淀尽可能除去酒精，风干。加50L TE溶解DNA。2.2.4 农杆菌工
9、程菌液的制备 用接种针沾取重组农杆菌EHA105，涂于含10g/ml Rif（利福平）和100g/ml Kan（卡那霉素）的细菌培养基上，置于28下的光照培养箱中培养40hr左右，待培养基上长出单菌落，用灭菌牙签挑取单菌落置于含10g/ml Rif和100g/ml Kan的液体细菌培养基内，在28下，转速160转的摇床中水浴培养16hr左右，观察培养基变混浊，取少许用用紫外分光光度计测其在600纳米波长下的吸收值为0.6-1.0。部分菌液与50的甘油以7:3的比例混匀，置于-70下保存备用。部分菌液用灭菌离心管收集，4000g离心力下离心，倒掉上清，再加入无菌水稀释至OD600=0.6-1.0
10、，即可用做接种外植体的工程菌液。2.2.5 叶盘共培养法转化烟草1) 共培养(1) 取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.80.8cm左右的叶盘，放在MS1培养基上，防止脱水。(2) 将大约200片叶盘放入两瓶200ml农杆菌培养液中，190rpm，28摇床上共培养10min。(3) 用药勺捞出叶盘，放在灭菌的吸水纸上，吸干叶盘上的多余菌液。(4) 将吸干的叶盘平放在加盖一层滤纸的MS1培养基上，用封口膜封好培养皿，25左右，于暗处共培养约60h。2) 诱导丛生芽(1) 共培养60h以后，按以下步骤将叶盘表面农杆菌洗掉，其间不时摇动，使叶盘充分接触溶液： 无菌水15min； 无菌
11、水羧苄青霉素（500mg/L）15min；c）MS0羧苄青霉素（500mg/L）20min。(2) 用药勺捞出叶盘，放在吸水纸上，吸干多余水分。(3) 将叶盘背面向下，放在MS2培养基上，叶盘边缘轻压如入培养基中。(4) 用封口封好培养皿，25左右，16h光照培养。(5) 约两周后，切下带芽的叶缘，插入MS2培养基上继续培养。3) 诱导生根在MS2培养基上诱导约四周后，将叶缘长出的幼芽从基部与叶盘切开，将幼芽插入MS3培养基中诱导生根，对每一棵苗进行编号，25左右，16h光照培养。4) 再生植株的移栽 诱导生根一月以后，大部分苗已长出繁茂的跟，可将PCR阳性苗移入珍珠岩中，用1/10MS水培培
12、养基培养。当株高达到20cm左右，根系比较发达以后，将烟草移入土中栽培。2.3 少量抽提植物总DNA（用于PCR 检测）2.3.1在一装有400l DNA 提取缓冲液的离心管中，用玻棒磨碎约12cm2 的新鲜叶片；2.3.2 室温离心1min；2.3.3 取上清液，加入400l 氯仿/异戊醇，充分颠倒混匀，4C 离心2min；2.3.4 取上清液，加入5l RNase 溶液，65C 保温30min；2.3.5 加入400l 氯仿/异戊醇，充分颠倒混匀，4C 离心2min；2.3.6 取上清液，加入800l 无水乙醇，颠倒混匀，-20C 静置20min，4C 离心10min；2.3.7 弃上清液
13、，用70%乙醇洗涤两次后，室温放置30min，待干燥后加入50l TE 溶解，-20C 保存。2.4 转基因烟草的PCR 检测取1.5l 小量提取的DNA 为模板用于PCR 检测。2.4.1 PCR 反应体系ddH2O 15.25lPCR buffer(10X) 2.5lMgCl2 (25mmol/L) 1.5ldNTP mix(10 mmol/L) 1l NPR1 P1(10mol/L) 1.5lNPR1 P2(10mol/L) 1.5lTaq DNApolymerase(5u/l) 0.25l模板 1.5l 25l2.4.2 PCR 反应程序95C 3min94C 1 min 55C 1
14、min 30cycles72C 3min 72C 10min3.结果分析3.1 叶盘法转化烟草3.1.1 共培养共培养60h 以后，可观察到叶盘已经开始长大，一些过于幼嫩、面积较小的叶片可能在操作中已死亡，这种叶盘呈水浸状或褐化，可弃而不用。共培养结束后共得到155 块叶盘，将其转入诱导培养基中诱导丛生芽。3.1.2 诱导丛生芽叶盘转入MS2 培养基中约4 天以后可以观察到未受农杆菌侵染的对照组叶盘在MS2 培养基上膨大不明显，在继代培养中，只产生极少数芽点，这些芽长势缓慢，在以后的选择培养中不能生根，逐渐死亡。而转基因苗叶盘明显长大，叶盘边缘开始变白，一周以后，叶盘几乎完全变白，膨大变厚，边缘有凹凸不平的突起。继续培养，边缘突起变大，开始产生绿色芽点，转基因烟草在卡那霉素选择培养基上能正常生长，而未转基因的烟草则不能正常生长见图31。叶盘在MS2 培养基上培养约一月以后，丛生芽可长至23cm，见图版42。3.1.3 诱导生根选择长势较好的芽，将其从基部切下，插入MS3 中诱导生根。实验中共得到无菌苗169 棵。在两周以后进行生根统计，其中128 株苗生根，生根率约为76。根的发育状况直接影响苗的长势，部分PCR 阳性苗根系发
