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1、NDV一步法RT-PCR的一些初探NDV一步法RT-PCR的一些初探 摘 要: 本文对抽取模板RNA的不同方法进行了比较，并采用RT-PCR一步法扩增出875bp的目的片段，通过PCR产物的直接测序，得出其的基因序列；后把目的片段克隆至T easy载体中，再测序后与PCR直接测序结果进行比较。并为以后做相 应的基因工程苗打下了基础本文对抽取模板RNA的不同方法进行了比较，并采用RT-PCR一步法扩增出875bp的目的片段，通过PCR产物的直接测序，得出其的基因序列；后把目的片段克隆至T easy载体中，再测序后与PCR直接测序结果进行比较。并为以后做相 应的基因工程苗打下了基础。关键词：新城疫
2、病毒；HN基因；RT-PCR新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)是引起鸡的急性败血性疾病。为养禽业的重要烈性传染病。NDV属于副粘病毒科，为单股负链(-ss)RNA结构。有囊膜，囊膜上有F蛋白HN蛋白纤突，具有致病性有免疫原性。F蛋白则负责病毒的融合穿透，HN蛋白使病毒粒子能够吸附细胞受体1。国内已对F基因和HN基因进行研究并取得了一些进展，如曹殿军等2克隆了我国标准强毒F48E9株的HN基因并进行了测序，贺东生等对F基因进行了测序，并与大肠杆菌融合表达制备了相应的基因工程3,4。本研究对我国的4株NDV地方强毒株进行了克隆和测序，并对其基因系统发育情况与国外的
3、毒株作了初步的比较和分析，为以后做相 应的基因工程苗打下了基础。1 材料1. 1 病毒：采自广东省某地方新城疫病毒(NDV)强毒株，标记为NDV-FS2。1.2 菌种：DH5，本室保存1.3质粒：T easy vector购自Promega公司1.4 引物：根据gene bank中的强毒株MIYADERA的HN序列设计引物,引物跨度为897bp，并在两个引物5端引入内切酶位点EcoR和 sal 。引物由上海生工代为合成。引物序列如下：p3：TC GAATTC TGCAGTGTGAGTGCTACT。Tm3=49, Tp3=61.4p4：GC GTCGAC CTTGACAACTTTAAAACA。T
4、m4=41, Tp4=55.6前两个碱基为保护性碱基，GAATTC为EcoRI酶切位，GTCGAC为Sal I的酶切位点。p3p4跨幅897bp。1.5 RT-PCR Kit和EcoR、sal 均为promega产品1.6 RNA抽提液:Trizol 为GibcoBRL产品1.7 RESNcolumnTM琼脂糖DNA纯化系统：华美公司产品2 方法2.1 病毒的繁殖采集广东省不同地方疑为患NDV而死亡的病鸡肝，加适量的生理盐水，于病料研磨器中研磨。取上清液于EP管中，15 X1000 RPM离心10min，取中间层上清液于0.22m无菌滤器中进行过滤除菌。为保险起见，再加庆大至终浓度为100U/
5、ml。尿囊腔接种9天龄的鸡胚，收获24hr以后死亡的鸡胚尿囊液。12 X1000 RPM离心10min，以去除大分子颗粒蛋白。然后分装于EP管中，0.5ml/管。2.2 器材的处理2.2.1 EP管、Tip头的处理：0.05%DEPC三蒸水浸泡过夜，高压消毒30 min，100烤箱5hr。2.2.2 玻璃器皿的处理：0.05%DEPC三蒸水浸泡过夜，高压消毒30min，180烤箱24hr。2.2.3 无RNA酶三蒸水的制备：0. 1%DEPC三蒸水室温放置30hr，高压消毒30min去除剩余的DEPC。2.3 核酸的抽提2.3.1 常规法抽提模板RNA取上述尿囊液0.5ml，加入蛋白酶K(10
6、mg/ml)20，10%SDS 100l,37作用2hr，分别用等体积的饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)、氯仿各抽提一次，取上层水相加入1/10体积的NaAC(Ph4.8)和倍体积的无水乙醇，-20过夜沉淀。16 X1000 RPM离心20min，弃上清。用75%乙醇冼沉淀除盐，30min后16 X1000 RPM离心10min，后用5l无RNA酶的水溶解沉淀。2.3.2 Trizol抽提模板RNA取上述尿囊液0.5ml，加入Trizol 0.5ml，吹打混匀，25作用10min,再加入0.2ml的氯仿,混匀后25作用5min, 14 X1000 RPM离心10min，取上清于等体积
7、的异丙醇中室温沉淀30min，14 X1000 RPM离心10min，弃上清后用75%乙醇冼沉淀除盐，30min后16 X1000 RPM离心10min，后用5l无RNA酶的水溶解沉淀。2.4 采用一步法进行RT-PCR按以下反应体系进行RT-PCR：(l) H2O: 22 30 29 295 X buffer: 10dNTP mix(0.2mM) 1Mgso4(1mM): 2P3(0.8M) 2P4(0.8M) 2AMV(5U/50l) 1DNA polymerase(5U/50l) 1模板RNA: 10 1 2(10-1) 2(10-2)总体积: 50 45反转录2hr，加50l石蜡油,
8、942min灭活逆转录酶,于PCR扩增仪上进行如下扩增:94 60s55 45s72 120s重复35循环72 600s2.5 HN基因的分子克隆将RT-PCR 扩增的片段50l于50V电泳30min，于紫外灯下切下目的条带，按RESNcolumnTM琼脂糖DNA纯化系统说明回收目的片段,无水乙醇沉淀后加水l溶解。建立如下加尾体系：(l)DNA: 6.810 X buffer: 1MgCl2: 1dATP(0.2mM): 0.2Taq酶(2U/10l): 1总体积: 1070加A 30min建立如下连接体系：(l)2 X Rapid ： （）： （l）： 总体积： 连接24hr。取l转化DH5
9、大肠杆菌，同时含AMP(200mg/ml)培养板上涂布X-gal(750g/皿)和IPTG(800g/皿)33hr后涂布转化菌。过夜后挑取白色菌落进行电泳初步筛选和酶切鉴定。6.送转化菌于基康公司进行测序3 结果3.1 RT-PCR一步法扩增NDV HN 基因(图一):NDV-FS2-HN毒株进行RT-PCR一步法扩增后，出现一条分子量为897bp的条带。3.2 NDV-FS2-HN毒株的PCR 产物直接测序结果:NDV-FS2-HNHN 基因的分子克隆电泳可疑质粒用Eco R I进行酶切,可得到一个大约分子量为897bp的条带。同时进行质粒测序。4 讨论4.1 RNA的抽提我们采用三种方法对
10、0.5ml尿囊液中的NDV的模板进行了抽提，均取得了较好的结果。同时我们加大了加倍了蛋白酶K的使用浓度，终浓度为20mg/ml，SDS使用浓度为2%。用75%乙醇冼涤沉淀后，室温自然干燥20min。Trizol RNA抽提液是用来抽提组织细胞中的RNA。但用来抽提尿囊液中的病毒RNA效果也较好。异硫氰酸胍抽提时却未能获得好的结果。因此作者认为：常规抽提核酸的方法经济，且重复性好。在整个RNA的抽提过程中，预防RNA酶的污染是非常重要的。整个操作进程要经过严格除RNA酶处理。同时抽提时要勤换手套。4.2 RNA模板量的选择我们采用不同浓度RNA作模板，发现当向一管抽提物中加50l 无RNA酶的水
11、时，溶解后取2l作模板，可取得较好结果。若模板量加入太多，可能存在有一些抑制物，却扩增不出来。4.3 T easy Vector 的克隆T easy Vector 是一个很好的载体，载体本身是一个开环。不同酶在PCR产物3末端可形成钝端或多一个碱基A。若是多一个碱基A，无需加A即可；若为钝端，则应用Taq酶进行加A后与载体连接。4.4 PCR产物直接测序与克隆后测序的比较为了方便快捷，同时更为了经济，可对PCR产物进行直接测序。但为了比较与克隆至载体后，两者之间的差异。我们把目的基因克隆至T载体后同时进行测序。对两者之间进行了比较，发现两者之间的相同率为100。说明若时间紧迫，仍可对PCR产物
12、直接进行测序。参考文献1.长绪，刘福安，杜伟贤，中国兽医学报，1996 16(6) 527-5322.殿军，刘春丽，王莉林，中国兽医学报，1997 17(4) 326-3303.东生，吴红专， 秦智锋，刘福安，畜牧兽医学报 2000 31(3) 224-2284.东生， 秦智锋，刘福安，动物医学进展 2000 21(第2期) 5.Lomnicz, E.Wehmann, J.Herceg, A.Ballagi-Pordany Arch Virology(1998)143:49-646.ngela Oberdorfer & Ortrud WernerAvain pathology(1998) 27,237-2437.S.Collins. Sally Franklin, I.Strong, G.MeulemansAvain pathology(1998) 27,90-968.aniel J. King and Bruce S. Seal Avain diseases 42:507-516 1998137
