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1、1陕西地区乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型作者：张岩白雪帆李新红李羽谢玉梅康文臻赵玉玲 【关键词】 肝炎病毒 关键词: 肝炎病毒，乙型;基因型;聚合酶链反应;多态性，限制性片段长度 摘 要:目的 了解陕西地区乙肝病毒（HBV）基因分型情况. 方法 用套式 PCR 方法从 100 份 HBsAg 阳性的乙型肝炎患者血清中扩增585bp 的 S 基因，用限制性内切酶 Bsr，Sty，Dpn和Hpa平行酶切鉴别 HBV AF 基因型. 结果 所有标本用内引物P1 和 P2 均扩增获得的 585bp 的靶基因，继之用上述限制性内切酶消化鉴定，证明 100 份血清标本中的 HBV 可分为 B 型 36
2、份（36%） ，C 型 56 份（56%） ，D 型 8 份（8%）. 结论 陕西地区HBV 分型以 B，C 型为主，D 型较少，未发现 A，E ，F 型.结果同时表明 PCR-RFLP 方法灵敏性高，特异性强，且酶切图谱简明单一，易于识别，适用于 HBV 基因型的流行病学调查和临床实验研究 . Keywords:hepatitis B virus;genotype;polymerase chain re-action;polymorphism，restriction fragment length 2Abstract:AIM To investigate the genotypes of H
3、epatitis B virus（ HBV）in Shaanxi province.METHODS The585bp length of HBV S gene was amplified from the blood samples of100patients with HBsAg positive using polymerase chainreaction（PCR）.The PCR products were digested with four kinds of restriction enzymes，Bsr ，Sty，Dpnand Hpato determine the genotyp
4、ing of HBV.RESULTS By PCR-RFLP，HBV from patients with hepatitis B can be di-vided into three types，i.e.type B，C and D，and the per-centages of type B，type C and type D were36%， 56%and8%respectively.CONCLUSION Genotype of HBV in Shaanxi mainly consists of type B and type C，and type D is rare in this r
5、egion. 0 引言 已知乙型肝炎病毒（HBV）可分为 A，B，C，D，E ，F，G7个基因型1-3 ，我国主要以 B 型和 C 型为主，D 型比较少见，少数民族多以 D 型为主，还未发现其他型别4 .人类感染不同基因型 HBV 可能与感染途迳、疾病的感染谱及疾病的进展有一定的相关5 .目前进行 HBV 分型的方法主要有 3 种:病毒全基因组或S 基因序列测定和分析1 ，2 ;聚合酶链式反应 -限制性片段长3度多态性分析（PCR-RFLP ） 6 ; 单克隆抗体酶联免疫吸附法7 .由于病毒基因测序法技术较为复杂，不便于临床或流行病学调查工作中常规应用;单克隆抗体分型法则难以从基因水平上对 H
6、BV进行分型，因此我们选用 PCR-RFLP 进行 HBV 的基因型别鉴定，以了解陕西地区 HBV 流行毒株的型别和特点 . 1 对象和方法 1.1 对象 选取本院保存的陕西籍慢性乙型肝炎患者血清标本100（男 62，女 38）份;年龄 460（平均 32.44.2）岁.全部标本HBsAg 阳性，临床诊断标准符合第五届全国传染病和寄生虫病学术会议制定的病毒性肝炎防治方案. 1.2 检测方法 1.2.1 血清 HBV-DNA 的提取 取 20L 血清加 40L DNA裂解液，在沸水中煮 10min，离心后吸取上清液待检. 1.2.2 套式 PCR 外引物核苷酸（nt）序列为:S1（nt2820-
7、2837，5-GGGACACCATATTCTTGG-3 ）和 S2（nt842-822， 5-TTAGGGTTTAAATGTAT-ACCCA-3）;内引物的 nt 序列为:P1（nt203-221，5-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3 ）和P2（nt788-768，5-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3 ） ，所有引物均由天津九鼎鑫公司合成. 41.2.3 PCR 扩增及限制性内切酶酶切分析 两轮套式 PCR 按常规进行.第 1 轮 PCR 反应系统组成为: 待检上清液 4L，10PCR缓冲液 5L，dNTP4L，S1/S2 各 1.5L，加无离子水至 50L 反应体积.
8、扩增条件 :94预变性 300s，94变性 30s，55退火30s，72延伸 60s，共扩增 35 个循环.第 2 轮 PCR 反应系统组成为: 第 1 轮反应产物 4L，10PCR 缓冲液 5L，dNTP4L，P1/P2各 1.5L，Taq 酶 2U，加无离子水至 50L 反应体积.扩增条件和循环次数同第 1 轮 PCR8-10 .扩增的靶基因经琼脂糖电泳初步鉴定粗纯后分成若干份，选择限制性内切酶Sty，Bsr，Hpa，Dpn分别或组合进行酶切11 ，取消化产物 810L 加入 20gL-1 琼脂糖凝胶上进行电泳，根据不同的电泳图谱进行 RFLP 分析以确定 HBV 基因型. 2 结果 2.
9、1 基因型与 S 基因限制性片段长度多态性的关系 经用内引物 P1 和 P2 扩增获得的的靶基因片段长度为 585bp（Fig1） ，其中HBV C 基因型在此片段中的第 301 位有限制性内切酶 Sty的酶切位点，识别序列为 CC（A/T ） （A/T）GG，应分解为 332bp 和253bp 两个片段;HBV B 基因型毒株在第 174 位有 Bsr的酶切位点，识别序列为 CCAGT，可被分解为 126bp 和 459bp 两个片段，5依此可准确鉴定 B 型（Fig2）;92%A 型和 100%E 型在此片段的第348 位有 Bsr 酶切位点，可被切成 300bp 及 285bp 两个片段
10、，Hpa仅在 E 型第 552 位有酶切位点，识别序列为 CCGG，被切成 81bp 和 504bp 两个片段，可准确鉴定 100%E 型;Dpn在 C 型中无酶切位点，在全部 A，B，E 及 95%D 型第 337 位有酶切位点，识别序列为 GATC，被切成 289bp 和 297bp 两个片段，可准确鉴定 95%D 型; 但独在 F 型第 337 位和 593 位有酶切位点，被切成257bp，289bp，40bp 三个片段; 可准确鉴定 97%F 型.Sty，Bsr在 D 型中无酶切位点，可以初选 D 型，再进一步用Dnp鉴定 11 .HBV 基因型与 S 基因 RFLP 的关系见 Tab
11、1. 表 1 4 种限制性内切酶对不同基因型 HBV-S 基因的切割部位略 图 1 图 2 略 2.2 100 例乙肝患者血清标本中 HBV 的基因分型 经 RFLP分析，100 例患者血清标本中 36 份 HBV 基因型为 B 型，56 份为C 型， 8 例为 D 型，未发现 A，E，F 型. 3 讨论 乙型肝炎病毒（HBV）基因型分型标准是依据全基因序列同源性92%或 S 基因序列同源性 96%1 ， 2 .基因型反映了HBV 自然感染过程中的变异特点，是病毒变异进化的结果 .目前大量6HBV 基因序列的分析研究提示 S 基因序列比较稳定，但是相对而言不同基因型 HBV 的各个基因序列中
12、S 基因的异质性最大，而同一基因型中的毒株 S 基因异质性相对较小，因而 S 基因适于基因分型.HBV 的基因型分布在不同地理区域有不同的特点 7 ，如 A 型主要分布于北欧、西欧和非洲撒哈拉沙漠地带;B，C 型主要分布于亚州东、南部;D 型分布的范围最广，是地中海地区和南亚如印度的优势基因型，也见于亚洲少数民族;E 型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带;F 型主要分布于美国的土著人群中;G 型发现于法国和美国. 我国HBV 基因南方以 B 型为主，北方以 C 型为主，D 型仅见于西藏和新疆. 我们采用 PCR-RFLP 方法11 ，对陕西地区慢性乙型肝炎患者血清中 HBV 的基因分型结果表明，陕西
13、地区基本符合我国北方的特点，以 B 和 C 型为主，同时也发现少量的 D 基因型，未发现A，E，F 型.结果还表明，以检测 HBV S 基因为基础的 PCR-RFLP分型方法，可鉴定 95%以上的标本，具有较高的特异性和准确性. 人类感染 HBV 病毒的基因型别可能与感染途迳、疾病的感染谱、疾病的进展有一定的相关性5 .有研究认为 A 型与慢性活动性肝炎，D 型与急性自限性肝炎相关，C 型与慢性乙型肝炎病情加重、发展为肝硬化和肝癌可能密切相关，而 35 岁以下发展为肝癌与 B型相关.病毒基因型与疾病的关系还有待进一步研究探讨. 参考文献: 71Okamoto H，Tsuda F，Sakugaw
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