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1、1镉致腺垂体 -肾上腺皮质凋亡机制研究【摘要】 目的 观察 CdCl2 作用后腺垂体 肾上腺皮质系统凋亡情况及半胱天冬酶9 的表达变化。方法 48 只雄性 SD 大鼠随机分为4 组，即对照组、CdCl2 低剂量组(10mg kg) 、中剂量组(20mgkg)、高剂量组 (40mgkg) 。经口灌胃染毒，每周5d，连续 6 周。染毒结束后分离腺垂体和肾上腺皮质进行透射电镜观察、末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记法(TUNEL) 检测细胞凋亡、半胱天冬酶原9mRNA(procaspase9mRNA) 表达、半胱天冬酶9(caspase9) 表达。结果 电镜检查可见凋亡细胞早期形态学
2、变化；中、高剂量组腺垂体和肾上腺 TUNEL 阳性细胞的平均灰度值和 procaspase9 mRNA 阳性细胞相对灰度值均为对照组的 12 倍以上(P005) ；蛋白印迹（western boltting)结果显示，随着染毒剂量的增加，垂体-肾上腺系统 caspase9 表达逐渐增强(P99 ，广州化学试剂厂)；焦碳酸二乙酯(DEPC, 美国 Amresco 公司)；procaspase9mRNA 原位杂交试剂盒(武汉博士德公司)；ZeissAxiovert 研究型显微镜(德国 ZEISS 公司 )；JVC ky2F30B 32CCD 彩色图像摄录输入仪( 日本 JVC 公司);Kontro
3、n IBAS215 型全自动图像分析系统(德国 Kontron 公司） ;SpectraA240 型原子吸收分光光度计(美国 Spectra 公司)。313 实验方法 将 48 只动物随机分为 4 组，每组 12 只，分别于每天上午 89 时经口灌胃给予10，20 ，40mg kgCdCl2 溶液，阴性对照组灌胃给予等体积蒸馏水，每天 1 次，每周 5d，连续 6 周。于染毒结束的次日晨89 时断头处死大鼠，留取血清、腺垂体、肾上腺皮质进行测定：(1)应用石墨炉- 原子吸收分光光度法测定血清镉水平； (2)取部分腺垂体和肾上腺皮质置于戊二醛中性甲醛液中固定、制片、染色，HITACHI 600
4、型透射电镜观察腺垂体和肾上腺皮质细胞超微结构变化；(3)采用原位末端标记法检测(TUNEL)细胞凋亡，并分析 TUNEL阳性细胞的平均灰度；(4)采用原位杂交法并分析Procaspase9mRNA 表达水平；(5)用聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白印迹 化学发光法检测 caspase9 表达水平并用全自动图像分析系统进行吸光度分析。14 统计分析 采用 SPSS 100 软件进行方差分析、回归分析、相关分析等。2 结果21 血镉水平变化 (表 1) CdCl2 染毒 6 周后，3 个剂量组大鼠血镉水平明显升高，(P005) ，且随染毒剂量的增加，血镉水平呈不断升高趋势，回归方程为4Y=0718+011
5、1x(P005,R2=0885)。22 腺垂体和肾上腺皮质细胞形态学改变 电镜可见，中、高剂量组腺垂体细胞及 3 个剂量组肾上腺皮质细胞均出现了线粒体肿胀成空泡状，嵴模糊甚至消失；细胞核体积缩小，核膜不规整，染色质边聚等细胞凋亡征象。23 TUNEL 法原位检测凋亡(表 1) 结果表明，中、高剂量组腺垂体组织和肾上腺皮质组织中 TUNEL 阳性细胞平均灰度值与对照组比较呈现增高，凋亡细胞的平均灰度随 CdCl2 剂量增加趋于增强，呈明显的剂量依赖关系，以剂量为自变量，腺垂体组织TUNEL 阳性细胞平均灰度值为因变量的回归方程为Y1=24648+4002x(P005，R2=0684) ，肾上腺皮
6、质组织 TUNEL 阳性细胞平均灰度值为因变量的回归方程为Y2=23143+506x(P001，R2=0894) ；相关分析结果表明，腺垂体组织和肾上腺皮质组织 TUNEL 阳性细胞平均灰度之间的 Pearson 相关系数 r=0895(P001)。24 Procaspase9mRNA 表达水平 20，40mg kg CdCl2 可影响腺垂体组织 procaspase9 mRNA 的表达。回归分析结果显示，随着 CdCl2 剂量的增加，procaspase9mRNA 的表达逐渐增强，呈明显的剂量 效应关系。回归方程为5Y3=0499+0053x（P001 ，R2=0560) ；3 个染毒剂量组
7、 CdCl2 均可影响肾上腺皮质细胞 procaspase9 mRNA 表达，以剂量为自变量，procaspase9 mRNA 表达水平为因变量的回归方程为 Y4=0640+0078x(P001，R2=0804) ；相关分析结果表明，腺垂体组织和肾上腺皮质组织 procaspase9 mRNA表达水平之间的 Pearson 相关系数 r=0895(P001)。腺垂体procaspase9 mRNA 表达水平与 TUNEL 阳性细胞平均灰度之间的 Pearson 相关系数 r=0912（P001 ） ，在肾上腺皮质组织，二者的 Pearson 相关系数 r=0793（P001 ） 。25 cas
8、pase9 表达水平 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白印迹 化学发光法进行检测。结果显示，在腺垂体组织和肾上腺皮质组织 caspase9 的表达随着 CdCl2 染毒剂量的增加均逐渐增强，表现为目的条带的积分吸光度(OPTDI)逐渐增大。表 1 大鼠血镉、腺垂体和肾上腺皮质凋亡及 procaspase9 mRNA、caspase9 表达结果（略）注：与对照组比较，a P0.05,b P0.013 讨论急慢性接触镉对机体多种组织器官均可产生损害作用2-4 。6本研究发现，镉在整体和离体均可对肾上腺皮质产生一定的损害作用5-7 。腺垂体 肾上腺皮质系统在维持机体稳态方面发挥着极其重要作用的同时也是外源
9、性化合物的靶点。本研究显示，低剂量镉亚慢性作用于机体可致腺垂体和肾上腺皮质均出现染色质边聚等凋亡表征。进一步研究显示，镉亚慢性染毒可使腺垂体和肾上腺皮质细胞 DNA 断裂，表现为 TUNEL 反应阳性，而且在腺垂体和肾上腺皮质组织 TUNEL 反应阳性细胞绝对灰度水平呈现出良好的一致性，从而在形态学和分子水平上均表明镉可致腺垂体 肾上腺皮质系统发生凋亡。蛋白酶信号转导系统在凋亡过程中的重要作用已引起广泛关注8-10 ，其中半胱天冬酶(caspase) 家族被认为是诱发和执行凋亡最为关键的信号分子11，12 ，而半胱天冬酶9(caspase9)是半胱天冬酶级联反应的最上游成员13，14 ，其存在
10、与否可作为判断凋亡是否发生的早期指标。本研究显示，caspase9 及其酶原 mRNA(proca spas9 mRNA)表达也呈现明显的剂量 效应关系，且在腺垂体和肾上腺皮质组织 caspase9 及procaspase9 mRNA 表达和 TUNEL 阳性细胞之间均呈现出良好的相关性，提示 caspase9 在镉诱导腺垂体 肾上腺皮质细胞凋亡过程中可能发挥了一定作用。【参考文献】1 Lafuente A,Blanco A,Marquez N,et al.Effects of acute and subchronic cadmium administration on pituitary 7
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13、611.5 魏青，杨杏芬，陈铁江，等.重金属的肾上腺皮质毒性与机制研究.氯化镉影响肾上腺皮质激素合成分泌机制的整体实验研究J.中国职业医学，1999，26(5)：1-3.86 赵敏，杨杏芬，魏青，等. 氯化镉诱发肾上腺皮质细胞凋亡与应激活化蛋白激酶活性的研究J.中华预防医学杂志，2000，34(6)：342-344.7 Zhu W,Yang XF,Wei Q,et al.The effect on apoptosis in anterior pituitary induced by cadmium chloride and its relation with caspase-9 pathway
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