《铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析【关键词】铁皮石斛/化学；, 石斛碱/生物合成；,基因文库 摘要：【目的】构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。【方法】以 Trizol 一步法从 4 年生的铁皮石斛中提取总 RNA，分离纯化 mRNA，LD_PCR(longdistancepolymerasechainreaction)法反转录合成双链 cDNA，以 TripIEX2 为载体，构建铁皮石斛cDNA 文库，文库滴度以每 mL 含噬菌斑形成单位(pfu)的数目来表示，PCR 扩增鉴定插入片段。 【结果】成功地构建了铁皮
2、石斛cDNA 表达文库，原始文库的噬菌斑滴度为 43105?pfu/mL，总克隆数为 31105，重组率为 976%，扩增后文库总滴度为68109?pfu/mL，对随机挑取的噬菌斑进行 PCR 鉴定，结果插入片段多分布在 0520?kb 之间，绝大部分在 1217?kb 左右。 【结论】文库质量鉴定结果表明，所构建的铁皮石斛 cDNA 文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。 关键词：铁皮石斛/化学；石斛碱/ 生物合成；基因文库 中药功能基因的研究逐渐成为中药现代化研究的一个热点，因为功能基因和次生代谢酶基因决定了有效成分的结构与功能，是中药现代化的关键环节之一 。在植物中药功能
3、基因研究中，与基因组测序和表达序列标记(expressedsequencetag，ESTs)测序相比，药用活性成分生物合成相关基因的研究更受到重视，克隆基因的数2量呈上升趋势，预示着天然产物后基因组时代的开启及一些天然产物生产方式的可能变革。人们期望克隆中药有效成分的功能基因，并通过基因工程与化学的有机结合而形成新的基因药物。 石斛为名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。石斛碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，也是最早从石斛中分离出来的化合物2-3 ，为分离、克隆石斛碱相关功能基因，本文构建了铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆全长石斛碱生物合成相关功能
4、基因并进行功能鉴定奠定基础。1 材料与方法 11 材料供试铁皮石斛采自云南大理，由中国科学院华南植物研究所叶秀嶙研究员提供，保种于本实验室。 12 主要试剂与仪器 Trizol 试剂酶购自 Gibco 公司；信使核糖核酸(mRNA) 分离纯化试剂盒购自 Promega 公司；cDNA 文库试剂盒购自 Clontech 公司；SfiI 购自 Biolabs 公司；焦碳酸二乙脂(DEPC) 购自上海生工公司(Amresco 分装)；其他常规生化试剂均为分析纯。紫外分光光度计为 Pharmacia 公司的 Genequant;聚合酶链反应(PCR)仪为 PekingElemer 公司的 GeneAm
5、pSYSTEMS?9600。 13 总核糖核酸(RNA)提取及 mRNA 纯化取 4 年生新鲜的铁皮石斛，称取其叶片 100?mg，经清洗及用体积分数为 75%的乙醇消毒后，置研钵中加液氮迅速充分研磨，加 2?mLTrizol 试剂，余下操作按试剂盒说明进行；提取的总 RNA 用 12?g/L 的甲醛琼脂糖变性凝3胶电泳分析并鉴定其质量，用 100?LDEPC 水溶解储于-80 的超低温冰箱中备用；取 10?LRNA 用 DEPC 水稀释 50 倍后，采用分光光度计测量 260?nm/280?nm 处的吸光度(D) ，计算总 RNA 的得率，计算公式为：RNA=004 稀释倍数D260 采用亲
6、和素顺磁珠(SAPMPS)法从总 RNA 中分离纯化 mRNA。在无 RNA 酶(RNaesfree)的 Eppendorf 管中加入 01?mg 的总 RNA 和无 RNA酶的水至终体积为 500?L，65加热 10?min，加入 3?L 生物素标记的高聚脱氧胸苷酸Oligo(dT)和 13?L?20 倍的 SSC 缓冲液于 RNA 中，其余步骤按说明书及文献4-5方法进行。 14cDNA 的合成及文库的构建采用LongDistancePCR(polymerasechainreaction)法合成 cDNA 的第1 和第 2 链4-7 。在 05?mL 离心管中，加入 3?L 铁皮石斛mRN
7、A，按试剂盒方法加入相应试剂及引物，经反转录酶合成第 1链 cDNA；在 1 个 05?mL 的离心管中加入 2?L 第 1 链 cDNA，其余试剂按试剂盒要求加入，放入经预热到 95的 PCR 仪中。PCR反应程序如下：94变性 30?s，接着 94、5?s，68、6?min ，共 26 个循环；PCR 结束后，取 5?L 采用 11?g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。合成的 cDNA 经蛋白酶 K 处理去除蛋白质，经氯仿 /异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶 SfiI 酶切消化，过CHROMASpin400 柱分离纯化，除去分子量小于 400?bp 的cDNA 片段和杂质。 将分离的双链 c
8、DNA 片段按一定浓度与定向克隆到 SfiI 酶切的去4磷酸化的 TripIEX2 噬菌体连接，cDNA 按浓度梯度设计 3 个连接反应，cDNA 的用量分别为 05?L、10?L、15?L；并将连接产物用噬菌体包装蛋白进行包装构成 cDNA 原始文库，以 XL1_Blue 为受体扩增文库后，用噬菌体缓冲液收集于 4保存。 15cDNA 文库质量鉴定 151 滴度测定用噬菌体缓冲液分别将原始和已扩增的 cDNA 文库稀释不同倍数，加入 100?L 的 XL1_Blue 受体菌及 100?L 稀释液，37吸附 15?min；然后混合 2?mL 溶化的 LB/MgSO4 顶层软琼脂(48左右)，迅
9、速混匀到预热至 37的平板，快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀，顶层软琼脂凝固后，37倒置培养过夜，每隔2?h 检查噬菌斑生长情况。每 2?mL 的顶层软琼脂加 50?L?5 溴 4氯 3 吲哚 D 半乳糖苷(XGal，20?g/L) 、50?L 异丙基硫代 D 半乳糖(IPTG，20?g/L) ，计数噬菌斑形成单位(plagueformingunit，pfu) ，按下列公式计算文库滴度：npfu/( 个mL-1)=(N 噬菌斑 稀释倍数)/V 受体菌 152 文库重组率的测定采用蓝白斑互选法测定重组率8-11 ，利用 XGal 显色原理，在测定滴度时加入 100?mmol/L 的 IPTG 及
10、 XGal，过夜培养，通过篮、白斑的数量计算文库重组率。 153cDNA 插入片段的 PCR 快速鉴定采用 TripIEX2 噬菌体 5PCR?primer 和 3PCR?primer 引物分别对构建的文库进行 PCR扩增，检查插入片段的长度；从 LB 平板上随机挑取 13 个独立的噬菌斑，分别加到含有 200?L 噬菌体缓冲液的 Eppendorf 管中，537放置 1?h 后，保存于 4 ；在 PCR 管中加入 3?L?10 倍的PCR 缓冲液、24?L2?mmol/L 脱氧核苷酸混合物(dNTP)、24?L25?mmol/LMgCL2、1?L?Tap 酶、 TripIEX2 上下游测序引
11、物各 10?pmol/L，加去离子水使总体积达 30?L。PCR 反应条件为 95预变性 4?min，95 变性 30?s，55退火 45?s，72 延伸 1?min，36 个循环，最后 72 延伸 10?min，反应在 PTC?220型 PCR 仪上进行，11?g/L?的琼脂糖凝胶电泳检测分析。 2 结果 21 总 RNA 及 mRNA 的质量提取的总 RNA 经分光光度计测定，测得 mRNA 的 D260nm 平均吸收值为 023，平均得率为046?g/L，D260nm/D280nm=19，无 DNA、蛋白质及小分子污染。提取的总 RNA 经 12?g/L 的甲醛琼脂糖变性凝胶电泳检测，出
12、现非常清晰的 28s?RNA(s 为沉降系数) 和 18s?RNA 两条带(图 1)，表明所提取的 RNA 基本上没有降解；加样孔处没有亮带，说明没有 DNA 和小分子物质的污染；mRNA 分离纯化后电泳呈弥散状，也证明了总 RNA 的完整性，说明提取的 RNA 质量很高，符合建库要求。 22cDNA 的合成及分析用 LDPCR 法合成 cDNA 第 1 和第 2 链之后，经 11?g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测，整个条带呈弥散状，结果显示合成的 cDNA 基本分布在 059?kb 之间(图 2)，中间有几条与组织特异性高丰度 mRNA 相对应的亮带，说明纯化的 mRNA 所合成的 cDNA 较
13、为完整、质量较好，合成的双链 cDNA 是成功的，6符合建库要求。23 文库的滴度、重组率及插入片断大小分析将包装产物稀释后进行原始文库的滴度检测，结果表明原始文库的滴度为43105?pfu/mL，总克隆数为 31105 个；扩增文库的滴度为68109pfu/mL。通过 XGal 显色原理测定重组率，计算蓝斑及白斑的数量，得到文库的重组率为 976%。从 LB 平板上随机挑取 13个噬菌斑的 PCR 鉴定，结果插入片段多分布在 0520?kb 之间，绝大部分在 1217?kb 左右(图 3)。 3 讨论 构建高质量的 cDNA 文库，是高效筛选目的基因的关键。而其前提是提取并分离出高质量的 m
14、RNA，因此提取纯度高、完整性好的mRNA 就成为 cDNA 文库构建的核心步骤，直接关系到文库的建立和文库的质量。植物组织中的 RNA 含量较低，而且离体植物组织的 RNA 降解速度很快，因此，铁皮石斛叶片采下后应迅速用液氮冷冻，然后放置-70中保存，以保证 RNA 不被降解。在提取过程中严格防止 RNA 酶的污染，并设法抑制其活性，是实验成败的关键。铁皮石斛 RNA 提取和 mRNA 分离的方法与其他植物的方法基本相同，但由于铁皮石斛多糖含量较高，我们采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法去除多糖，结合 LiCl 分离 DNA 和 RNA，加强了RNA 的纯化过程，取得了很好的效果，获得了
15、高质量的总 RNA；采用磁珠法分离 mRNA，简单、快速、方便，得到了纯净的mRNA。 文库的滴度、重组率及插入片段的大小是鉴定 cDNA 文库质量的7重要指标。本文运用了 LD_PCR 法合成 cDNA，使得低丰度的基因表达序列在文库中得到了富集，便于稀有 mRNA 的扩增和克隆。一般来说，文库的滴度达到 105pfu/mL 以上即为有效的文库12 。我们构建的 cDNA 文库的滴度为 43105pfu/mL，符合这一要求，文库的重组率为 976%，说明文库是完整的、有效的，并且质量较高。另外，我们选用容易质粒化的 TripIEX2 为 cDNA 的克隆载体，TripIEX2 具有多方面的优
16、点，它可以通过插入亚克隆而转至质粒载体或其他表达载体，每一个插入 TripIEX2 载体的多克隆位点(MCS)部位的 cDNA 均可通过全部 3 个阅读框架进行表达；且构建的文库滴度高，为应用快速末端扩增法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)克隆全长石斛碱生物合成相关功能基因奠定了基础。 参考文献： 朱平，王伟，程克棣.药用植物功能基因J.中国生物工程杂志，2004，24(2)：3. BiZhiming，WangZhengtao，XuLuoshanChemicalconstituentofDendrobiummoniliformeJ.ActaBotanicaSinica，2004，46(1)：124. MaGuoxiao，WangTianshan ，LiYin，etal.StudiesonChem
