《重组pDC316-MCMV- hNIS真核表达质粒的构建及在肿瘤细胞的功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组pDC316-MCMV- hNIS真核表达质粒的构建及在肿瘤细胞的功能研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1重组 pDC316-MCMV/ hNIS 真核表达质粒的构建及在肿瘤细胞的功能研究作者：周泉波， 陈汝福， 李志花， 周嘉嘉， 唐启彬， 陈积圣【摘要 】 【目的】 克隆人的钠/ 碘同向转运体(hNIS) 基因可编码序列，并研究其在非甲状腺肿瘤细胞内的功能表达。 【方法】 利用逆转录和聚合酶链反应（RT-PCR ）从毒性弥漫性甲状腺肿（又称Graves 病）病人的甲状腺组织中扩增得到 NIS 的可编码区基因，并克隆到 T 载体，测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒 pDC316 载体上，获得重组真核表达质粒载体 pDC316MCMV/ hNIS。采用脂质体转染的方法，把 pDC316-MCMV/
2、 hNIS 重组质粒（实验组）或 pDC316 空质粒（对照组）分别导入到胰腺癌细胞株 CAPAN-II细胞、PANC-1 细胞和卵巢癌细胞株 SK-OV-3 细胞，转染后 48 h采用 RT-PCR 方法检测转染细胞内的 hNIS mRNA 水平，转染后第2、3 、4 天分别检测肿瘤细胞对 125I 的吸收功能。 【结果】 序列分析结果证实克隆片段与文献报道的 hNIS 基因 cDNA 序列完全一致。实验组转染后 48 h，在 CAPAN-II 细胞、PANC-1 细胞及 SK-OV-3 细胞内均能检测到 hNIS mRNA 高水平表达，对照组基本无 hNIS mRNA 表达。转染后第 3
3、天细胞吸碘达到高峰，实验组 CAPAN-II细胞、PANC-1 细胞和 SK-OV-3 细胞对 125I 的吸收量分别比对照2组高 24 倍、17 倍和 13 倍。 【结论】 从 Graves 病人的甲状腺组织中克隆的 hNIS 基因转染肿瘤细胞后，能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能，为进一步运用放射性核素体内靶向治疗非甲状腺肿瘤奠定了基础。 【关键词】 人钠/ 碘同向转运体； 逆转录聚合酶链反应； 基因转染； 碘放射性同位素钠 /碘同向转运体 (sodium iodide symporter,NIS)是主要存在于甲状腺滤泡细胞基底膜上的一种跨膜糖蛋白,在细胞对碘的摄取过程中起着举足轻重的作用1。
4、随着对 NIS 研究的不断深入，通过NIS 基因介导放射性核素来进行肿瘤的基因治疗是目前国内外的研究热点之一2,3,但在胰腺癌基因治疗中少有报道4。本研究从Graves 甲亢病人的甲状腺组织中克隆出人 NIS 基因的完整编码区序列（CDS） ，并构建 Pdc316-MCMV/hNIS 重组穿梭质粒载体，以研究 NIS 基因转染的胰腺癌等非甲状腺肿瘤细胞对碘的摄取功能。1 材料与方法1.1 材料3Graves 甲亢病人的甲状腺组织取自我院乳甲外科。总 RNA 提取试剂 Trizol reagent 和脂质体 lipofectamine 2000 均为Invitrogen 公司产品, 2Pfu P
5、CR MasterMix（KP201）天为时代公司产品，两步法 RT-PCR 试剂盒 Takara 公司产品。限制性内切酶 EcoR 、Xba 、Hind 及 T4 DNA 连接酶购自 NEB 公司。coli DH5，pDC316 vector 由中山大学肿瘤医院实验室提供，pGEM-T easy 载体本试验室保存。胰腺癌细胞株 CAPAN-2 购买于中山大学细胞培养室,胰腺癌细胞株 PANC-1、卵巢癌细胞株 SK-OV-3 由本试验室保存。DMEM 培养基（GBICO 公司） 、四季青胎牛血清为威佳公司产品。放射性 125I、NaI 及 KClO4 均由中山大学实验核医学实验室提供。1.2
6、 NIS 基因的扩增及与 T 载体连接采用 Trizol 试剂法从 1 例 Graves 甲亢病人的甲状腺组织中抽提总 RNA 后, 使用 TaKaRa 公司反转录试剂盒把 RNA 反转录成cDNA,具体方法参考试剂盒说明书。根据重叠 PCR 方法设计 4 条引物以扩增 hNIS cDNA 全长 1932 bp 的基因片段：P1: ATGGAGGCCGTGGAGACCGGGGAAC；P2: CAAACATGACGATGCCACAGCAGGC；P3: CAGGT CGTGGTGATGCTAAGTGGCT；P4: TCAGAGGTTTG TCTCCTGCTGGTCT。分别建立如下 3 个反应体系:
7、 体系 1（扩增4产物为 Fragment 1）：取甲状腺 cDNA 1 L ,P1（10 pmol/L） 、P2(10 pmol/L) 各 5 L, 2Pfu PCR Master Mix 25 L,ddH2O 14 L。体系 2（扩增产物为 Fragment 2）：取 P3（10 pmol/L） 、P4(10 pmol/L) 各 5 L，其余成份同体系 1。体系 3（扩增产物为NIS 基因片段）：把 Fragment 1 和 Fragment 2 的 PCR 产物稀释50 倍后混合，取 1 L 此混合物作为模版， P1（10 pmol/L） 、P4(10 pmol/L)各 5 L，其余成份
8、同体系 1。3 个体系 PCR 反应的条件一致，如下:94 预变性 2 min,94 变性 30 s,65 退火 30 s,72 延伸 3 min ,共作 30 个循环,最后于 72 延伸 10 min,产物放于-20 冰箱中冻存。体系 3 的 PCR 产物行 1%琼脂糖电泳后，胶回收目的片段，并与 pGEM-T easy 载体相连，以方便保存目的基因及亚克隆到其他载体。连接产物转化大肠杆菌感受态 DH5，利用蓝/白菌落筛选法筛选出阳性克隆, 提取其质粒 DNA，进行Nco + Spe酶切鉴定。阳性克隆交由上海生物工程公司测序。1.3 pDC316-MCMV/hNIS 载体的构建根据腺病毒穿梭
9、质粒 PDC316 所包含的多克隆位点，采用 PCR方法在 hNIS 基因两端分别引入 EcoR和 Hind两个酶切位点，设计引物为 P5： TAGCGAATTCATGGAGGCCGTGGAGACCGG GG 和 P6:TAGCAAGCTTTCAGAGGTTTGTCTCCT GCTGG。以上述经测序证实为碱基序列正确的 pGEM-T easy/hNIS 质粒作为模5版，P5、P6 为引物扩增 NIS 基因，扩增产物经 EcoR和 Hind双酶切后回收，与 PDC316 载体连接后得到重组质粒 PDC316-MCMV/hNIS。重组产物酶切鉴定后转化到 DH5 大肠杆菌感受态后，用 LB/Amp
10、 平板筛选出阳性克隆送上海生物工程公司测序（本节具体方法同上段） 。1.4 体外转染在 24 孔板中接种处于对数生长期的胰腺癌细胞株 CAPAN-2、PANC-1 细胞,卵巢癌细胞株 SK-OV-3(1105/ 每孔),18 h 后待细胞生长至密度达到 90%95%进行转染。转染过程参考lipofectamine 2000 转染试剂说明书。1.5 RT-PCR 方法鉴定细胞内的 hNIS 基因的 mRNApDC316-MCMV/hNIS 质粒（实验组）和 pDC316 空质粒（对照组）转染 48 h 后，Trizol 试剂法从肿瘤细胞内提取总 RNA,采用TaKaRa 公司反转录试剂盒使 RN
11、A 反转录成 cDNA。然后根据hNIS 的 cDNA 序列设计特异性引物 P7:GCTAA GTGGCTTCTGGGTTG 和 P8：GACTGCAGCCAT AGCATTGA,用于扩增 hNIS cDNA 的部分基因片段（+941 +1 142）,以鉴定细胞内 hNIS 的 mRNA 表达水平。反应条件为: 94 预变性 2 6min,94 变性 30 s,60 退火 30 s,72 延伸 1 min,共作 30 个循环, 最后于 72 延伸 7 min，产物电泳分析。1.6 放射性 125I 吸收实验pDC316-MCMV/hNIS 质粒转染组为实验组 ,未经重组的PDC316(不含 N
12、IS 基因 )作为空白对照组 1，实验组另设 hNIS 抑制剂 KClO4 组做对照 2。每组每种细胞取 4 个复孔, 重复转染 3 次。转染细胞后第 2、3、4 天分别进行 125I 吸收测定。具体方法：细胞用 HBSS 溶液冲洗 2 次，在含 10 mmol/L HEPES, 10 mol/L NaI and 0.1 Ci Na125I/mL(pH 7.3)的 HBSS 溶液中,37 培养 1 h，对照组另加入 10 mol/L KClO4, 作为 NIS 吸碘的抑制剂。倒掉培养液，用冰 PBS 冲洗 2 次，然后 1 mol/L NaOH 裂解细胞，细胞吸 125I 用 计数仪测定每分钟
13、计数。2 结 果2.1 hNIS 基因（+348 +2279）的克隆PCR 扩增的产物电泳鉴定结果见图 1，结果证明扩增产物与预扩增片段大小一致。PCR 扩增产物亚克隆到重组质粒 pGEM-T easy/NIS 后,经 Nco + Spe酶切鉴定，表明插入片段正确（图72） 。重组质粒送上海生物工程公司检测碱基序列，插入基因的测序结果与参考序列 H.sapiens solute carrier family 5 (sodium iodide symporter),(GenBank accession : NM-000453)的 CDS序列完全匹配，同源性为 100。2.2 重组质粒 pDC31
14、6-MCMV/hNIS 构建的结果构建的 pDC316-MCMV/hNIS 重组质粒转化 DH5 后，用LB/Amp 平板筛选重组子,挑取阳性菌落, 小提质粒分别进行Xba+EcoR双酶切和 EcoR+Hind双酶切，酶切产物经电泳分析得到与预期片段大小一致条带（图 3） 。挑取阳性克隆送测序，重组质粒中的 hNIS 基因测序结果与 T 载体内的 hNIS 基因模版序列一致，与参考序列同源性为 100。2.3 肿瘤细胞内 hNIS 的 mRNA 水平RT-PCR 方法扩增 pDC316-MCMV-hNIS 质粒转染后肿瘤细胞内 hNIS 的部分编码基因片段（ +941+1 142） ，以检测细
15、胞转染后胞内 hNIS 基因的 mRNA 表达情况。扩增片段电泳鉴定（图 4） ，结果表明 pDC316-MCMV-hNIS 质粒转染 CAPAN-2、PANC-1和 SK-OV-3 细胞后都能扩增出约 500 bp 大小的目的条带，而所有空白组都不能扩增出目的条带。这表明转染组 NIS 基因的 mRNA在 CAPAN-2、PANC-1 和 SK-OV-3 均有较高水平表达，而对照组8（不含 NIS 基因）转染后没有 hNIS 的 mRNA 表达。2.4 肿瘤细胞的 125I 吸收转染后第 2、3、4 天分别进行细胞 125I 吸收测定，结果表明实验组转染后第 3 天细胞吸 125I 量最高，
16、在 CAPAN-2、PANC-1和 SK-OV-3 细胞内累计量分别为（ 2 859225）min-1、 （2 650214）min-1、 （3 105325）min-1，比对照组分别提高 24倍、17 倍和 13 倍, 实验组的高水平吸碘均能够显著被 KClO4 所抑制。结果表明：pDC316-MCMV/hNIS 转染组的 3 种细胞都有较高水平吸收 125I 的功能，并且这种 125I 的吸收功能都能够显著被NIS 功能抑制剂 KClO4 所抑制。对照组 pDC316 质粒（不含 NIS基因）转染后 3 种细胞 125I 的吸收水平都很低。3 讨 论钠 /碘同向转运体 (sodium iodide symporter,NIS)是一种跨膜糖蛋白,属于钠 /葡萄糖协同转运体家族。NIS 主要表达于甲状腺滤泡上皮细胞，另外在唾液腺、泪腺、胃黏膜、脉络丛、乳腺、卵巢等非甲状腺组
